2種幾丁質(zhì)酶基因超表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)蠟蚧菌的轉(zhuǎn)化.pdf

1、柑橘粉虱Dialeurodes citri(Ashmead)別名橘黃粉虱，不僅是柑橘類的重要害蟲(chóng)之一，還經(jīng)常為害梔子、女貞、丁香和柿等多種植物。近年來(lái)在我國(guó)柑橘產(chǎn)區(qū)均有分布，危害嚴(yán)重。柑橘粉虱主要以幼蟲(chóng)為害柑橘幼嫩葉片的背部，吸食汁液。該蟲(chóng)排泄出的蜜露覆蓋在葉片和果實(shí)表面上，呈現(xiàn)出黑褐色斑點(diǎn)，引發(fā)煤煙病。嚴(yán)重時(shí)，引起植株葉片變黃、脫落，導(dǎo)致整體樹(shù)勢(shì)變?nèi)?、果品變差。由于不同地區(qū)柑橘粉虱一年中發(fā)生期不整齊，且世代重疊，因此在危害嚴(yán)重時(shí)，仍然

2、以化學(xué)農(nóng)藥防治為主。
　　蠟蚧菌（Lecanicillium lecanii）是重要的生防真菌之一，主要寄生在蚜蟲(chóng)、粉虱、介殼蟲(chóng)類和螨類等上，可以在昆蟲(chóng)種群中引發(fā)流行病。很多研究人員的試驗(yàn)結(jié)果顯示，在穿透昆蟲(chóng)體壁過(guò)程當(dāng)中蟲(chóng)生真菌的幾丁質(zhì)酶有著特定的作用，因此把它當(dāng)作蟲(chóng)生真菌的一個(gè)重要的毒力因子。研究表明，應(yīng)用基因超表達(dá)技術(shù)可以強(qiáng)化蟲(chóng)生真菌毒力因子，提高蟲(chóng)生真菌對(duì)寄主的毒力，可以在短期內(nèi)達(dá)到擊倒害蟲(chóng)的效果，從而有效地推廣農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的生

3、物防治方法。
　　本學(xué)位論文以蠟蚧菌為研究對(duì)象，利用ClonExpress技術(shù)成功構(gòu)建了蠟蚧菌幾丁質(zhì)酶基因超表達(dá)載體（pRCy1∷Tchit1）和球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶基因超表達(dá)載體(pRCy1∷Bchit2)，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入蠟蚧菌中。研究結(jié)果有助于提高蠟蚧菌對(duì)柑橘粉虱的毒力，并為該菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)生物防治方面提供理論基礎(chǔ)。本學(xué)位論文的主要研究結(jié)果如下:
　　1.2種幾丁質(zhì)酶基因超表達(dá)載體的構(gòu)建
　　

4、首先提取蠟蚧菌總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。然后，設(shè)計(jì)兩端分別帶有酶切位點(diǎn)(XhoⅠ和XbaⅠ)序列的引物，并擴(kuò)增該基因完整的開(kāi)放閱讀(ORF)，擴(kuò)增的Tchit1基因序列與NCBI上登錄的蠟蚧菌幾丁質(zhì)酶基因chit1的序列相比，同源性為100％。再采用ClonExpress技術(shù)，將蠟蚧菌幾丁質(zhì)酶基因Tchit1的開(kāi)放閱讀框定向插入到絲狀真菌表達(dá)載體pRCy1上，構(gòu)建出蠟蚧菌幾丁質(zhì)酶基因超表達(dá)載體(pRCy1∷Tchit1)。以

5、同樣的方法構(gòu)建出球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶基因超表達(dá)載體(pRCy1∷Bchit2)。擴(kuò)增的Bchit2基因序列與NCBI上登錄的球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶基因chit2的序列相比，同源性為99％。
　　2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蠟蚧菌的轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證
　　首先將蠟蚧菌幾丁質(zhì)酶基因超表達(dá)載體（pRCy1∷Tchit1）和球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶基因超表達(dá)載體(pRCy1∷Bchit2)分別轉(zhuǎn)入AGL1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證和質(zhì)粒

6、雙酶切驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果正確后，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將Tchit1和Bchit2基因分別轉(zhuǎn)入蠟蚧菌TL001菌株中。再對(duì)蠟蚧菌假定轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR和RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明，Tchit1和Bchit2基因已經(jīng)成功導(dǎo)入TL001菌株中，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子能正常轉(zhuǎn)錄。遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子中插入的幾丁質(zhì)酶基因片段能夠穩(wěn)定遺傳。
　　3.蠟蚧菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子幾丁質(zhì)酶酶活測(cè)定
　　將蠟蚧菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株和野生菌株分別接種在蟬蛻培養(yǎng)基平板上，