水牛線粒體基因組結構及ATP8基因RNA干擾載體構建.pdf

1、研究背景與意義 中國是一個水牛資源極其豐富的國家，基于水牛細胞染色體核型分類，將亞洲水牛分成三種類型：沼澤型(核型2n=48，役用為主)，河流型(核型2n=50，乳用為主)及雜交型(核型2n=49，役用、乳用)。近年來，由于生物化學和現(xiàn)代遺傳學技術的發(fā)展，人們已開始進行試管水牛和克隆水牛繁殖的研究。開展水牛線粒體基因組結構和功能的研究，對于深入了解水牛發(fā)育過程中基因表達與調控的分子機理，核外基因與核內基因遺傳信息的相互作用及其與

2、母性遺傳性狀關系具有重要意義。另外，水牛線粒體基因組序列的測定可以豐富線粒體基因組數(shù)據(jù)庫，為進一步探討水牛起源和進化提供科學依據(jù)。線粒體直接影響ATP的合成，因而必然影響與體內能量代謝密切相關的重要經濟性狀。牛線粒體F<,0>部分包含ATP6和ATP8兩個亞基，但是線蟲線粒體基因組不包含ATP合成酶的另一個亞基ATP8基因，這與一般后生動物線粒體基因組有所區(qū)別。線粒體基因組分子進化分析亦表明，ATP8基因在哺乳動物線粒體13個編碼蛋白質

3、的基因中變異性較大，因此ATP8基因在線粒體能量代謝和細胞發(fā)育中的作用需要進一步研究。 目的 選擇具有代表性的中國水牛品種(沼澤型水牛)，提取并純化線粒體DNA，利用同源分析設計引物、PCR擴增水牛線粒體基因組不同區(qū)域片段測序，拼接各片段序列，并進一步獲得全序列。 分析水牛mtDNA序列基因組成、基因排列和基因結構并與其他已報道物種的線粒體DNA進行比較基因組研究，探討中國水牛線粒體DNA序列結構特點，進一步進行

4、水牛線粒體DNA分子進化分析。 選擇線粒體重要標記基因——ATP8基因，進行RNA干擾研究，探討其功能。 方法 1．用改進高鹽沉淀法，提取水牛線粒體DNA。 2．同源分析法設計多對引物，PCR測序，利用DNASTAR和Chromas2.22軟件對測序結果進行序列拼接，拼接后留下的少許空隙，重新設計引物測序，最后得到水牛線粒體全基因組序列。 3．生物信息學軟件分析水牛線粒體基因組組成和結構特征。

5、 4．siRNA載體表達法構建線粒體ATP8基因RNA干擾載體。 結果 1．中國水牛線粒體基因組基因組成與結構特點 中國水牛線粒體基因組全序列長度為16359bp，包含13個編碼蛋白質的基因、2個rRNA基因、22個tRNA基因和一段100p區(qū)序列。 通過序列對比和軟件分析推測了水牛線粒體DNA編碼的22個tRNA基因序列(包括二個tRNA<'Ser>和二個tRNA<'Leu>)及其二級結構，它們

6、的堿基長度在60～75之間，這些tRNA基因除tRN<'Pro>、tRNA<'Val>、tRNA<'Ser>(GCU)外都具有折疊成典型三葉草結構特征，包括氨基酸接受臂、二氫尿嘧啶(DHU)臂、反密碼子環(huán)、TψC環(huán)。中國水牛(2n=48)線粒體DNA編碼的12S rRNA和16S rRNA進化上高度保守，其中12S rRNA與奶牛(2n=60)或印度水牛(2n=50)的12S rRNA的同源性均為100％。水牛線粒體DNA編碼蛋白質的基

7、因序列除ND6在輕鏈外，其余在重鏈，包括7個NADH脫氫酶亞基(NADH dehydrogenase subunit)、3個細胞色素C氧化酶亞基(Cytochrome Coxidase subunit)、2個ATP合成酶亞基(ATPsynthase FO subunit)、1個細胞色素6編碼基因(Cytochrome 6)。這些編碼蛋白質的基因沒有內含子，有些與其它基因重疊少許堿基，起始密碼子包括AUG、AUA，終止密碼子包括UAA、U

8、AG及U。另外，水牛mtDNA中的UGA編碼色氨酸，而不是通常的終止密碼子，其機制有待進一步闡明，這些蛋白編碼基因總長11403bp，占全長的70％。 2．水牛線粒體分子進化分析 中國水牛、印度水牛和奶牛都屬于偶蹄目反芻亞目，它們之間蛋白編碼基因和氨基酸序列相互差異，在中國水牛和奶牛之間氨基酸差異從0.01％(COXI)到0.11％(ATP8)，平均值為0.06％。中國水牛和印度水牛之間氨基酸差異從0.00％(COYI)

9、到0.04％(ND4L)，平均值為0.02％。COXⅠ、COXⅡ和COX Ⅲ的核苷酸和氨基酸差異較小，而ATP8較大。ATP8分子進化樹表明水牛與海豹進化距離較遠，與奶牛、綿羊相對較近。 3．ATP8基因RNA干擾載體構建 基于ATP8 RNA二級結構設計合成RNA干擾寡核苷酸序列，重組質粒經過限制性內切酶及測序鑒定，表明了成功構建pGPHl／GFP／Neo-buffalo-shATP8 RNA干擾表達質粒。 結

10、論 1．完成中國水牛線粒體基因組全長測序及組成分析，并通過基因庫Genbank審查(NC 006295．1 GI：52220982)。 2．在中國水牛、奶牛、印度水牛之間線粒體13個蛋白編碼基因氨基酸序列差異分析中，發(fā)現(xiàn)中國水牛與奶牛(不同物種之間)的ATP8基因變異性最高，可作為牛乳制品分子鑒定的重要標記基因。同時，發(fā)現(xiàn)水牛不同品種間的ATP8基因變異性也較高，可作為品種篩選的重要標記基因。 3．構建水