水牛線粒體基因組結(jié)構(gòu)及ATP8基因RNA干擾載體構(gòu)建.pdf

1、研究背景與意義 中國是一個(gè)水牛資源極其豐富的國家，基于水牛細(xì)胞染色體核型分類，將亞洲水牛分成三種類型：沼澤型(核型2n=48，役用為主)，河流型(核型2n=50，乳用為主)及雜交型(核型2n=49，役用、乳用)。近年來，由于生物化學(xué)和現(xiàn)代遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們已開始進(jìn)行試管水牛和克隆水牛繁殖的研究。開展水牛線粒體基因組結(jié)構(gòu)和功能的研究，對(duì)于深入了解水牛發(fā)育過程中基因表達(dá)與調(diào)控的分子機(jī)理，核外基因與核內(nèi)基因遺傳信息的相互作用及其與

2、母性遺傳性狀關(guān)系具有重要意義。另外，水牛線粒體基因組序列的測(cè)定可以豐富線粒體基因組數(shù)據(jù)庫，為進(jìn)一步探討水牛起源和進(jìn)化提供科學(xué)依據(jù)。線粒體直接影響ATP的合成，因而必然影響與體內(nèi)能量代謝密切相關(guān)的重要經(jīng)濟(jì)性狀。牛線粒體F<,0>部分包含ATP6和ATP8兩個(gè)亞基，但是線蟲線粒體基因組不包含ATP合成酶的另一個(gè)亞基ATP8基因，這與一般后生動(dòng)物線粒體基因組有所區(qū)別。線粒體基因組分子進(jìn)化分析亦表明，ATP8基因在哺乳動(dòng)物線粒體13個(gè)編碼蛋白質(zhì)

3、的基因中變異性較大，因此ATP8基因在線粒體能量代謝和細(xì)胞發(fā)育中的作用需要進(jìn)一步研究。 目的 選擇具有代表性的中國水牛品種(沼澤型水牛)，提取并純化線粒體DNA，利用同源分析設(shè)計(jì)引物、PCR擴(kuò)增水牛線粒體基因組不同區(qū)域片段測(cè)序，拼接各片段序列，并進(jìn)一步獲得全序列。 分析水牛mtDNA序列基因組成、基因排列和基因結(jié)構(gòu)并與其他已報(bào)道物種的線粒體DNA進(jìn)行比較基因組研究，探討中國水牛線粒體DNA序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)一步進(jìn)行

4、水牛線粒體DNA分子進(jìn)化分析。 選擇線粒體重要標(biāo)記基因——ATP8基因，進(jìn)行RNA干擾研究，探討其功能。 方法 1．用改進(jìn)高鹽沉淀法，提取水牛線粒體DNA。 2．同源分析法設(shè)計(jì)多對(duì)引物，PCR測(cè)序，利用DNASTAR和Chromas2.22軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，拼接后留下的少許空隙，重新設(shè)計(jì)引物測(cè)序，最后得到水牛線粒體全基因組序列。 3．生物信息學(xué)軟件分析水牛線粒體基因組組成和結(jié)構(gòu)特征。

5、 4．siRNA載體表達(dá)法構(gòu)建線粒體ATP8基因RNA干擾載體。 結(jié)果 1．中國水牛線粒體基因組基因組成與結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 中國水牛線粒體基因組全序列長度為16359bp，包含13個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因、2個(gè)rRNA基因、22個(gè)tRNA基因和一段100p區(qū)序列。 通過序列對(duì)比和軟件分析推測(cè)了水牛線粒體DNA編碼的22個(gè)tRNA基因序列(包括二個(gè)tRNA<'Ser>和二個(gè)tRNA<'Leu>)及其二級(jí)結(jié)構(gòu)，它們

6、的堿基長度在60～75之間，這些tRNA基因除tRN<'Pro>、tRNA<'Val>、tRNA<'Ser>(GCU)外都具有折疊成典型三葉草結(jié)構(gòu)特征，包括氨基酸接受臂、二氫尿嘧啶(DHU)臂、反密碼子環(huán)、TψC環(huán)。中國水牛(2n=48)線粒體DNA編碼的12S rRNA和16S rRNA進(jìn)化上高度保守，其中12S rRNA與奶牛(2n=60)或印度水牛(2n=50)的12S rRNA的同源性均為100％。水牛線粒體DNA編碼蛋白質(zhì)的基

7、因序列除ND6在輕鏈外，其余在重鏈，包括7個(gè)NADH脫氫酶亞基(NADH dehydrogenase subunit)、3個(gè)細(xì)胞色素C氧化酶亞基(Cytochrome Coxidase subunit)、2個(gè)ATP合成酶亞基(ATPsynthase FO subunit)、1個(gè)細(xì)胞色素6編碼基因(Cytochrome 6)。這些編碼蛋白質(zhì)的基因沒有內(nèi)含子，有些與其它基因重疊少許堿基，起始密碼子包括AUG、AUA，終止密碼子包括UAA、U

8、AG及U。另外，水牛mtDNA中的UGA編碼色氨酸，而不是通常的終止密碼子，其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，這些蛋白編碼基因總長11403bp，占全長的70％。 2．水牛線粒體分子進(jìn)化分析 中國水牛、印度水牛和奶牛都屬于偶蹄目反芻亞目，它們之間蛋白編碼基因和氨基酸序列相互差異，在中國水牛和奶牛之間氨基酸差異從0.01％(COXI)到0.11％(ATP8)，平均值為0.06％。中國水牛和印度水牛之間氨基酸差異從0.00％(COYI)

9、到0.04％(ND4L)，平均值為0.02％。COXⅠ、COXⅡ和COX Ⅲ的核苷酸和氨基酸差異較小，而ATP8較大。ATP8分子進(jìn)化樹表明水牛與海豹進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，與奶牛、綿羊相對(duì)較近。 3．ATP8基因RNA干擾載體構(gòu)建 基于ATP8 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成RNA干擾寡核苷酸序列，重組質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶及測(cè)序鑒定，表明了成功構(gòu)建pGPHl／GFP／Neo-buffalo-shATP8 RNA干擾表達(dá)質(zhì)粒。 結(jié)

10、論 1．完成中國水牛線粒體基因組全長測(cè)序及組成分析，并通過基因庫Genbank審查(NC 006295．1 GI：52220982)。 2．在中國水牛、奶牛、印度水牛之間線粒體13個(gè)蛋白編碼基因氨基酸序列差異分析中，發(fā)現(xiàn)中國水牛與奶牛(不同物種之間)的ATP8基因變異性最高，可作為牛乳制品分子鑒定的重要標(biāo)記基因。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)水牛不同品種間的ATP8基因變異性也較高，可作為品種篩選的重要標(biāo)記基因。 3．構(gòu)建水