柑橘全爪螨種群遺傳結(jié)構(gòu)及全線粒體基因組序列分析.pdf

1、柑橘全爪螨(Panonychus cirri)隸屬蛛形綱(Arachnida)、蜱螨亞綱(Acari)、葉螨科(Tetranychidae),是一種世界性分布的柑橘害螨。在我國(guó),該螨發(fā)生面積廣、種群密度高、為害時(shí)間長(zhǎng),是大多數(shù)柑橘種植區(qū)的關(guān)鍵害蟲(chóng)(螨)之一。該螨能夠快速地對(duì)多種殺螨劑產(chǎn)生高水平抗性,增加了生產(chǎn)中對(duì)其有效防控的難度。目前,對(duì)該螨的研究很少涉及種群遺傳與進(jìn)化,這很大程度上源于缺乏有效的分子遺傳標(biāo)記以及單雌DNA提取的困難。深

2、入研究柑橘全爪螨不同地理種群的遺傳結(jié)構(gòu),有利于從分子水平上了解柑橘全爪螨的生態(tài)適應(yīng)機(jī)制和成災(zāi)規(guī)律,為制定有效的控制策略提供理論依據(jù)。近年來(lái),葉螨對(duì)新型線粒體靶標(biāo)殺螨劑聯(lián)苯肼酯等產(chǎn)生了嚴(yán)重抗性,據(jù)報(bào)道該類抗性源于線粒體cob基因的點(diǎn)突變。因此,測(cè)定柑橘全爪螨全線粒體基因組序列,不僅可以豐富蜱螨線粒體基因組數(shù)量,推動(dòng)蜱螨及其它節(jié)肢動(dòng)物動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)的研究,還可針對(duì)突變了的線粒體基因設(shè)計(jì)引物,進(jìn)而建立快速、準(zhǔn)確的田間抗性診斷技術(shù)。
　　

3、 本學(xué)位論文緊密?chē)@柑橘全爪螨種群遺傳與進(jìn)化這一重要科學(xué)問(wèn)題,致力于發(fā)掘柑橘全爪螨的微衛(wèi)星位點(diǎn),重點(diǎn)解析該螨的種群遺傳結(jié)構(gòu),測(cè)序獲得全線粒體基因組序列,分析葉螨線粒體基因組的進(jìn)化特點(diǎn),鑒定適于葉螨分子系統(tǒng)學(xué)研究的線粒體分子標(biāo)記,并構(gòu)建基于全線粒體基因組序列數(shù)據(jù)的蜱螨系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.在提取、純化柑橘全爪螨基因組DNA的基礎(chǔ)上,采用磁珠富集法構(gòu)建了柑橘全爪螨AC、TC和ATG等3個(gè)微衛(wèi)星富集文庫(kù)。對(duì)3個(gè)

4、富集文庫(kù)的部分陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,獲得了44個(gè)可進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的微衛(wèi)星位點(diǎn)。序列分析表明,柑橘全爪螨AC富集文庫(kù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)大部分以多拷貝的形式存在,部分以微衛(wèi)星DNA家族的形式存在。因此,TC文庫(kù)和ATG文庫(kù)中發(fā)掘的微衛(wèi)星位點(diǎn)更適合作為分子標(biāo)記研究該螨的種群遺傳結(jié)構(gòu)。在富集文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中,筆者通過(guò)將酶切、接頭連接一步化,減少了酶切產(chǎn)物的損失,提高了酶切產(chǎn)物的量,有效地提高了微衛(wèi)星的富集效率。
　　 2.聯(lián)合線粒體cox1基因和核

5、糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1序列,分析了15個(gè)柑橘全爪螨地理種群的遺傳多樣性、種群遺傳分化及基因交流模式,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)基于線粒體cox1基因的數(shù)據(jù)顯示,15個(gè)地理種群中共發(fā)現(xiàn)22個(gè)單倍型;基于核ITS1序列的數(shù)據(jù),共發(fā)現(xiàn)134個(gè)單倍型。綜合兩種分子標(biāo)記的結(jié)果推測(cè),15個(gè)柑橘全爪螨地理種群具有相對(duì)較高的遺傳多樣性,這可能是該螨在各地能夠頻繁成災(zāi)、對(duì)殺螨劑快速產(chǎn)生抗性的遺傳基礎(chǔ);(2)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖顯示,來(lái)自同一種群或相同柑橘

6、種植區(qū)的柑橘全爪螨的cox1單倍型或ITS1單倍型,均未能聚集在一起。AMOVA分析表明,柑橘全爪螨在本論文所涉及的長(zhǎng)江中上游(UMYR)、云貴高原(YGP)和華南(SC)等3個(gè)柑橘種植區(qū)間無(wú)顯著的種群遺傳結(jié)構(gòu)。如果分析時(shí)去除云南玉溪和湖北丹江口種群時(shí),僅基于線粒體cox1基因數(shù)據(jù)的AMOVA分析發(fā)現(xiàn),柑橘全爪螨在3個(gè)柑橘種植區(qū)間存在顯著的種群遺傳結(jié)構(gòu)。僅基于核ITS1序列數(shù)據(jù)的AMOVA分析表明,當(dāng)來(lái)自長(zhǎng)江中上游柑橘種植區(qū)(UMYR)

7、和云貴高原柑橘種植區(qū)(YGP)的種群作為一個(gè)組群時(shí),柑橘全爪螨存在顯著的種群遺傳結(jié)構(gòu)。此外,基于核ITS1序列數(shù)據(jù)的AMOVA分析還發(fā)現(xiàn),寄主植物對(duì)柑橘全爪螨種群遺傳結(jié)構(gòu)具有顯著影響?？傮w上看,柑橘全爪螨大多數(shù)種群間遺傳分化不顯著,這可能是因?yàn)槭艿讲糠址N群之間存在高水平的基因流、保留有較大的祖先多態(tài)性以及自然選擇(如寄主植物、殺螨劑等)等多個(gè)因素的共同影響;(3)盡管大多數(shù)種群間遺傳分化不顯著,特別是一些地理上相距很遠(yuǎn)的種群間還存在高水

8、平的基因流(如眉山和廣東種群間),但基于兩種分子標(biāo)記的Mantel檢驗(yàn)結(jié)果均表明,地理隔離仍然是柑橘全爪螨種群遺傳分化的重要原因之一。柑橘全爪螨體小、無(wú)翅,主動(dòng)遷移能力非常有限。因此,柑橘全爪螨的長(zhǎng)距離遷移和種群間的基因交流,很大程度上依賴于柑橘種苗的運(yùn)輸?shù)热祟惢顒?dòng);(4)基于兩種分子標(biāo)記的中性檢驗(yàn)、誤配分析及星狀分布的單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖均支持,柑橘全爪螨在歷史上經(jīng)歷了種群擴(kuò)張事件;(5)基于上述研究結(jié)果及柑橘全爪螨快速發(fā)展的抗藥性問(wèn)題,

9、在制定該螨的控制策略時(shí),對(duì)于抗性基因在不同種群間的擴(kuò)散及進(jìn)化應(yīng)予高度重視。
　　 3.采用Long-PCR和Sub-PCR技術(shù),克服了葉螨線粒體基因序列高A+T含量及基因高度重排等因素造成的PCR擴(kuò)增、測(cè)序困難等問(wèn)題,成功測(cè)定了柑橘全爪螨全線粒體基因組序列。柑橘全爪螨全線粒體基因組具有以下特點(diǎn):(1)柑橘全爪螨線粒體基因組在目前已測(cè)序的節(jié)肢動(dòng)物中最小,但并不缺失經(jīng)典后生動(dòng)物線粒體基因組所包含的37個(gè)基因;(2)與節(jié)肢動(dòng)物線粒體基

10、因的模式排序(鱟的線粒體基因排序)相比,柑橘全爪螨線粒體基因組發(fā)生了一系列的重排事件,其中2個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因區(qū)塊的倒位最為顯著,此外,24個(gè)RNA基因也高度重排;(3)柑橘全爪螨線粒體最大的非編碼區(qū)長(zhǎng)度僅為57bp,完全由堿基A和T組成,且可形成穩(wěn)定的莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu),推測(cè)該非編碼區(qū)是線粒體控制區(qū);(4)柑橘全爪螨線粒體基因組具有極高的A+T含量,在已測(cè)序的蜱螨線粒體基因中僅略低于蘋(píng)果全爪螨。這種高的A+T含量,也反應(yīng)在蛋白質(zhì)編碼基因的密碼

11、子使用上,即以A或T結(jié)尾的密碼子,占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在62種無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體密碼子中,柑橘全爪螨線粒體基因組僅使用了其中的57個(gè)密碼子,而未使用5個(gè)富含GC的密碼子。此外,與大多數(shù)后生動(dòng)物相反,柑橘全爪螨線粒體基因組J-鏈的GC-偏斜為正值;(5)柑橘全爪螨線粒體基因組中僅3個(gè)tRNA基因(trnN、trnL2和trnK)能形成經(jīng)典的三葉草結(jié)構(gòu),而其余19個(gè)tRNA基因均缺少D-臂或T-臂;trnI的反密碼子環(huán)為非典型的8個(gè)核苷酸,trnM和

12、trnS1在反密碼子莖上各有1個(gè)堿基錯(cuò)配,13個(gè)tRNA基因在氨基酸接受臂上存在1至3個(gè)不等的堿基錯(cuò)配;(6)柑橘全爪螨線粒體基因組2個(gè)rRNA基因發(fā)生倒位而由J-鏈編碼,rrnL和rrnS長(zhǎng)度的顯著減小導(dǎo)致其丟失了多個(gè)螺旋結(jié)構(gòu),但與蒼白纖恙螨(Leptotrombidiumpallidum)和戶塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)具有相似的莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　 4.以全爪螨屬的柑橘全爪螨(包括2

13、個(gè)地理種群)、蘋(píng)果全爪螨和葉螨屬的二斑葉螨、神澤葉螨為對(duì)象,采用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)的研究手段,從科內(nèi)、屬內(nèi)和種內(nèi)等三個(gè)層次,系統(tǒng)分析了葉螨線粒體基因組的分子進(jìn)化特征及其遺傳分化水平。結(jié)果表明:(1)4種葉螨線粒體基因組在已測(cè)節(jié)肢動(dòng)物中最小,但均包含經(jīng)典后生動(dòng)物線粒體基因組所具有的37個(gè)基因。與其它蜱螨和節(jié)肢動(dòng)物相比,葉螨線粒體基因組的相對(duì)減小,主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)編碼基因、rrnL和控制區(qū)的長(zhǎng)度都顯著縮短;(2)4種葉螨線粒體基因排序

14、完全一致,具有極高的A+T含量,蛋白質(zhì)編碼基因存在強(qiáng)烈的密碼子使用偏向性,但全爪螨屬物種未使用的富含GC的密碼子數(shù)量略高于葉螨屬物種;(3)全爪螨屬物種J-鏈的GC-偏斜為正值,A+T富集區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有2個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu),而葉螨屬J-鏈的GC-偏斜為負(fù)值,A+T富集區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)僅有1個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu);(4)4種葉螨線粒體基因組中的tRNA基因極不典型,19個(gè)tRNA基因均缺少D-臂或T-臂,有的tRNA基因甚至同時(shí)缺少D-臂和T-臂。此外,部分t

15、RNA基因與鄰近基因高度重疊,部分tRNA基因在氨基酸接受臂或反密碼子莖上存在堿基錯(cuò)配,而trnI的反密碼子環(huán)均為非典型的8個(gè)核苷酸。但是,葉螨的這些不典型tRNA基因不可能是假基因,因?yàn)?2個(gè)tRNA基因序列在4種葉螨中高度保守,特別是反密碼子臂;氨基酸接受臂上或反密碼子莖上的堿基錯(cuò)配可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后的RNA編輯而得以校正;在線蟲(chóng)中已證實(shí),缺少T-臂的tRNA基因具有正常的生物學(xué)功能;不典型的tRNA基因在真螨總目中非常普遍。然而,由于對(duì)

16、同時(shí)缺少D-臂和T-臂的tRNA基因是否具有正常的生物學(xué)功能還未知,因此有必要進(jìn)一步開(kāi)展功能性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn);(5)4種葉螨線粒體基因組的rRNA基因具有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu),但柑橘全爪螨的rrnL有其余3種葉螨均缺少的H3螺旋結(jié)構(gòu)。與5'-端相比,rrnL的3'-端在4種葉螨線粒體基因組中更為保守,特別是螺旋結(jié)構(gòu)G16-G20,而rrnS二級(jí)結(jié)構(gòu)中的19、21、32、33、49和50等6個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)最為保守;(6)基于全線粒體基因組序列、13個(gè)蛋白

17、質(zhì)編碼基因序列、24個(gè)RNA基因序列的分析表明,4種葉螨屬間的遺傳分化程度遠(yuǎn)大于屬內(nèi)和種內(nèi)。二斑葉螨和神澤葉螨之間的P-距離小于蘋(píng)果全爪螨和柑橘全爪螨間的P-距離,但遠(yuǎn)高于柑橘全爪螨兩個(gè)品系間的P-距離;(7)葉螨線粒體基因組的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中,僅3個(gè)基因(cob、cox3和had1)的密碼子數(shù)在4種葉螨中完全一致,其余10個(gè)基因的密碼子數(shù)均不相同。序列進(jìn)化分析表明,cox1、cox2和cob最為保守,表明適于葉螨較高分類階元的系

18、統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究:而atp8、nad2、had6和nad4L等4個(gè)基因的遺傳分化較高,適于作為分子標(biāo)記來(lái)研究葉螨種內(nèi)的遺傳多樣性或界定近緣物種間的系統(tǒng)親緣關(guān)系。
　　 5.基于已測(cè)序的28種蜱螨線粒體全基因組序列數(shù)據(jù),在系統(tǒng)評(píng)價(jià)堿基組成異質(zhì)性的基礎(chǔ)上,采用最大似然法(ML)和貝葉斯推斷法(BI)構(gòu)建了蜱螨亞綱內(nèi)各類群的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。盡管28種蜱螨線粒體基因組序列存在顯著的堿基組成異質(zhì)性,但基于PCG123、PCG12和PCG2等3

19、個(gè)數(shù)據(jù)集構(gòu)建的ML樹(shù)和BI樹(shù),以及基于PCG-RNA和PCG1等2個(gè)數(shù)據(jù)集構(gòu)建的ML樹(shù),均很好地反應(yīng)出目前普遍接受的蜱螨亞綱內(nèi)各類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,支持蜱螨亞綱中寄螨總目和真螨總目均為單系群的觀點(diǎn)。寄螨總目的蜱目和中氣門(mén)目均為單系群,蜱目由硬蜱和軟蜱兩個(gè)互為姊妹群關(guān)系的單系群構(gòu)成,而中氣門(mén)目中的植綏螨總科與皮刺螨總科互為姊妹群,兩者再與胭螨總科構(gòu)成姊妹群關(guān)系。真螨總目由絨螨目和疥螨目?jī)蓚€(gè)互為姊妹群的單系群組成;絨螨目的游殖螨亞目和寄殖螨