戊型肝炎病毒基因分型的標(biāo)準(zhǔn)化.pdf

1、戊型肝炎(hepatitis E,HE)是繼甲型肝炎外另一種經(jīng)腸道傳播的嚴(yán)重危害人類健康的病毒性肝炎.戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)是其病原體,為單股正鏈RNA病毒.明確HEV的基因型對(duì)于戊型肝炎的診斷、預(yù)防及流行病學(xué)具有重要意義.針對(duì)HEV基因分型的現(xiàn)狀,本研究通過設(shè)計(jì)通用性引物,嘗試?yán)媚孓D(zhuǎn)錄-巢式聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增各基因型HEV基因組部分序列,并與文獻(xiàn)已報(bào)道的通用性引物擴(kuò)增的PCR片段比較

2、,篩選最適的HEV基因組區(qū)段以替代全序列進(jìn)行HEV基因分型,從而統(tǒng)一用于HEV基因分型的基因組區(qū)段.同時(shí)利用全基因序列計(jì)算所得數(shù)據(jù),建立用于HEV基因分型的基因同源性及遺傳距離的標(biāo)準(zhǔn),并在基因分型的同時(shí)提出統(tǒng)一的命名規(guī)則,使HEV基因分型進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化.本研究實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下兩部分:一、基于不同基因組區(qū)段進(jìn)行HEV基因分型根據(jù)GenBank中已登錄的37株不同基因型HEV全序列,在HEV序列保守區(qū)設(shè)計(jì)MJ-A、MJ-B、MJ-C、MJ

3、-D 4組引物,同時(shí)檢索文獻(xiàn)找出其它已有報(bào)道的20組通用性引物.通過兩因素及單因素統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,分析基于24組引物擴(kuò)增區(qū)段的基因同源性和遺傳距離數(shù)據(jù)與基于全序列的數(shù)據(jù)在不同基因型及同一基因型內(nèi)有無差異,找出與全序列無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的區(qū)段;比較基于該區(qū)段及基于基因組全序列進(jìn)行的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果,進(jìn)一步證明該區(qū)段可替代全序列用于基因分型.依據(jù)全序列計(jì)算所得的遺傳距離、基因同源性,建立HEV的分型標(biāo)準(zhǔn),以系統(tǒng)進(jìn)化分析驗(yàn)證.二、通用性引物RT-PCR

4、擴(kuò)增不同基因型HEV用篩選得到的最適引物MJ-C進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增Ⅰ~Ⅳ型HEV標(biāo)準(zhǔn)株,檢測其通用性,并用于HEVIgM陽性的臨床標(biāo)本RT-PCR檢測及基因分型.本研究通過生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析,成功篩選出位于HEV RNA多聚酶功能域的基因組區(qū)段(4254~4560nt)可以替代HEV基因組全序列進(jìn)行基因分型,該區(qū)段側(cè)翼序列保守,可用于擴(kuò)增不同基因型HEV;同時(shí)基于全基因組序列分析,建立HEV基因分型標(biāo)準(zhǔn)為基因型間遺傳距離大于0