不同基因型戊型肝炎病毒抗原表位的研究.pdf

1、戊型肝炎(HepatitisE，HE)是一種經(jīng)糞口途徑傳播的急性傳染病，具有發(fā)病急、癥狀重、死亡率高等特點，在世界各地發(fā)展中國家廣泛流行，在發(fā)達國家也有散發(fā)，嚴重危害著人類健康。在散發(fā)病例中，HE約占急性病毒型肝炎總數(shù)的10％～20％，病死率約為0.4％，遠較其他各型肝炎高，特別是孕婦患者的死亡率可高達20％左右。戊型肝炎病毒(HepatitisEVirus，HEV)是HE的病原體，無包膜，其基因組為單股正鏈RNA，含三個開放讀碼框(O

2、penReadingFrame，ORF)ORF1、ORF2和ORF3。根據(jù)全基因組序列分析，HEV在全世界主要有4個基因型：以緬甸株為代表的第Ⅰ基因型、以墨西哥株為代表的第Ⅱ基因型、以美國株為代表的第Ⅲ基因型和以中國株為代表的第Ⅳ基因型，其中第Ⅰ基因型至少包括3個亞型，分別以緬甸株(Ia)、巴基斯坦株(Ib)和摩洛哥株(Ic)為代表。流行病學資料顯示Ⅳ型HEV是目前引起我國散發(fā)性HE的主要病毒株?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)豬、嚙齒類動物、牛、雞、羊等也可

3、以感染HEV，它們在HE傳播中可能起了重要作用，使該病成為一種人畜共患疾病。 目前HE的診斷主要依靠免疫診斷。由于缺乏有效的組織培養(yǎng)體系，目前多采用基因工程表達的重組蛋白或合成肽作為HEV特異性抗體檢測的包被抗原。但由于抗原選用的問題，現(xiàn)有HE診斷試劑的特異性和敏感性尚不理想。有學者研究發(fā)現(xiàn)，基因工程表達的ORF2全長蛋白可溶性差，其C端的抗原表位由于肽鏈的折疊而被遮蓋，切去N端部分肽鏈的ORF2蛋白抗原性反而更好。因而現(xiàn)在，根

4、據(jù)ORF2C端部分基因序列表達的重組蛋白已被廣泛應用于HEV抗體檢測及疫苗研究中。Meng等的研究發(fā)現(xiàn)，HEVORF2基因編碼的一段由452～617位氨基酸組成的重組蛋白(簡稱p166)含有HEV構(gòu)型依賴性中和抗原表位。當以不同基因型和亞型的p166對HE病人和實驗感染動物血清進行抗體ELISA滴定時，發(fā)現(xiàn)血清抗體滴度的高低與所用抗原的基因型明顯有關，提示不同基因型HEV可能具有不同的抗原表位。因此，有必要對不同基因型HEV抗原表位的差

5、異進行深入研究。我們曾通過制備單克隆抗體(McAbs)進行抗原表位分析，發(fā)現(xiàn)HEV第Ⅰ基因型重組蛋白(p166Bur)和第Ⅱ基因型重組蛋白(p166Mex)既含有HEV共同的抗原表位，又含有基因型特異性的抗原表位，提示HEV第Ⅲ、Ⅳ基因型的重組蛋白中也可能含有不同于第Ⅰ、Ⅱ基因型的抗原表位。 為此，本研究采用代表HEV第Ⅲ基因型的美國株p166(p166Us)為免疫原，制備抗-p166Us的McAbs，進一步分析不同基因型HEV

6、重組蛋白p166的抗原表位特點，并探索基因工程表達的重組蛋白與天然HEV顆粒之間抗原表位的關系，進而為新一代HE免疫診斷試劑的開發(fā)以及疫苗的研制提供新的思路。本研究分為三部分： 一、抗HEVp166Us單克隆抗體的制備與鑒定 首先，表達并純化了代表HEV第Ⅲ基因型美國株的ORF2-GST融合蛋白p166Us，親和層析純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，所表達的重組蛋白純度較高。在此基礎上，進一步選用HEVp166Us重組

7、蛋白作為免疫原，常規(guī)免疫Balb/c雌性小鼠，運用B細胞雜交瘤技術，最終成功獲得了6株穩(wěn)定分泌抗-HEVp166UsMcAbs的雜交瘤細胞株，分別命名為：4D3、2E3、11E11、12H5、3A3和1F1。它們分泌的McAbs均只與p166Us重組蛋白結(jié)合，不與單獨包被的GST發(fā)生反應，表明所研制的McAbs是針對HEV重組蛋白的特異性抗體。 二、不同基因型HEVp166重組蛋白抗原表位的分析 采用間接法ELISA和免

8、疫印跡法(Westernblot)，檢測我們所制備的6株McAbs分別與7種不同基岡型和亞型的HEVp166重組蛋白的免疫反應性。并利用計算機輔助序列分析的方法，比較GenBank中已經(jīng)登錄的39株不同基因型和亞型的HEV毒株(涵蓋了HEV4個主要的基因型)在D166重組蛋白區(qū)段氨基酸序列的基因型相關性變化。實驗發(fā)現(xiàn)，間接法ELISA和免疫印跡法的檢測結(jié)果完全一致，在最終獲得的6株雜交瘤細胞株中：4D3分泌的McAb與7種p166重組蛋

9、白均發(fā)生反應；2E3、11E11和12Hs分泌的McAbs只與p166Us、p166Nz和p166Chn發(fā)生反應；而3A3分泌的McAb只與p166Us及p166Nz結(jié)合；1F1分泌的McAb只與p166Us結(jié)合。在本研究中我們還利川計算機輔助序列分析的方法，比較了39株不同基因型HEV在p166重組蛋白區(qū)段的氨基酸序列，獲得了許多生物信息學的分析結(jié)果，一方面部分佐證了上述實驗結(jié)果，另一方面，所顯示出的不同基因型HEV在氨基酸序列上的特

10、征性改變?yōu)榭乖砦坏亩ㄎ惶峁┝酥匾木€索。因此，我們認為不同基因型和亞型HEVORF2編碼蛋白p166上存在多種類型抗原表位，其中包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ基因型共同的抗原表位，Ⅲ、Ⅳ基因型共有的和第Ⅲ基因型特異的抗原表位等。 三、重組蛋白p166與天然HEV顆粒之間抗原表位關系的分析 通過采川抗原或抗體競爭ELISA的方法，比較不同基因型HEV毒株以及經(jīng)RT-nPCR檢測證實為不同基因型HEV感染病人陽性血清分別對我們所制備的

11、4種類型McAbs與HEVp166Us重組蛋白問反應的競爭抑制作用，來分析p166重組蛋白與天然HEV顆粒之間抗原表位的關系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，McAb4D3與免疫原p166Us的結(jié)合可被Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ型天然HEV顆?；虿∪搜甯偁幰种?；以McAb2E3為代表，它與p166Us的結(jié)合僅能被Ⅲ和Ⅳ型HEV病毒顆?；虿∪搜逅种?；McAbs3A3和1F1兩者均能被Ⅲ型美國株競爭抑制，而Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型天然HEV顆?；虿∪搜宀荒芤种扑鼈兣cp166Us

12、的結(jié)合。由此可見，競爭試驗的結(jié)果與上述McAbs同各種不同基因型p166的反應情況一致，說明p166重組蛋白上存在與天然HEV顆粒上相同或相似的抗原表位，具有同樣的免疫反應性。此外，在本研究中我們還利用基于PCR的細胞培養(yǎng)體外中和試驗證實了，McAbs4D3和2E3對于天然HEV顆粒與敏感細胞(人肝癌7721細胞)之間的感染吸附具有中和作用，提示此2株McAbs不僅是針對HEVp166重組蛋白的特異性抗體，而且是具有免疫保護作用的抗-H

13、EV中和抗體，它們在p166重組蛋白上所針對的抗原表位應是中和抗原表位，從而為我們進一步的HEV中和抗原表位的定位研究奠定了基礎。 綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，不同基因型和亞型HEVORF2編碼蛋白p166上存在多種類型抗原表位，其中包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ基因型共同的，Ⅲ、Ⅳ基因型共有的和第Ⅲ基因型特異的等，這些表位與天然HEV顆粒上的抗原表位具有相同的免疫學特征，說明用基因工程技術表達的p166重組蛋白上的抗原表位可以模擬天然H

14、EV顆粒上相應的表位結(jié)構(gòu)；并且通過基于PCR的體外中和試驗還證實，此抗原表位應是HEV中和抗原表位，從而為HEV基因工程疫苗的研制和開發(fā)提供了科學依據(jù)。正是鑒于HEV存在多種基因型，不同基因型的HEV顆粒上存在多種類型的抗原表位，用單一基因型的HEV重組病毒蛋白或合成肽作為包被抗原的ELISA免疫診斷試劑，對于感染不同基因型HEV毒株的HE病人存在一定程度的漏檢和誤診，因此我們認為采用HEV多基因型和亞型混合抗原應是HEV抗體檢測的最佳