低溫顯微鏡下孔雀魚、斑馬魚精子超低溫冷凍研究初探.pdf

1、低溫顯微鏡已成為低溫生物學研究中一個非常重要的技術,人們借助這一技術可以直觀的觀察到生物樣品在冷凍和復溫過程中的形態(tài)變化,以及溶液相變的過程,從而分析生物材料的相關特性和生物體的低溫損傷機理以及確定最佳的降溫、復溫程序,并以此為依據(jù)客觀的解釋實驗結果、修正理論模型和制定合理的治療或保存程序。低溫冷凍臺和SYBR/PI雙染色結合使用可以直接檢測實驗過程中各階段精子膜的完整性。本文的研究內(nèi)容主要是通過低溫顯微鏡篩選孔雀魚精子超低溫冷凍條件和

2、檢測斑馬魚精子在各速率下冷凍到各溫度段的膜完整性這兩個方面。
　　 在對孔雀魚(Poecilia reticutata)精子的超低溫冷凍研究中,主要研究孔雀魚精子對溫度的敏感性和篩選冷凍速率、解凍速率、抗凍劑的種類和濃度,并分析冷凍過程中觀察到的精子彎曲溫度、停止運動溫度、結冰溫度和解凍溫度等參數(shù)與精子解凍后活力的關系。精子敏感性判斷是通過低溫顯微鏡觀察沒有加抗凍劑的HBSS-精子懸液從35℃到-8℃,再復溫到35℃整個過程來評

3、定精子鞭毛構型、游動行為和活力的變化。冷凍速率篩選選用5,25,45,65℃/min和1,25,100℃/min兩組實驗?？箖鰟┑暮Y選包括14％甘油,10％二甲基亞砜,6％甲醇,5％二甲基乙酰胺四種不同種類抗凍劑和7％,14％,28％和50％四種濃度的甘油。復溫速率篩選選用5,25,45和100℃/min。敏感性實驗結果顯示隨著溫度的降低,精子直線前進運動減慢,精子鞭毛由彗星式對稱擺動在9℃左右開始發(fā)生中段彎曲,并約在-5.5℃停止擺動

4、。在復溫過程中精子在-1.9℃左右恢復鞭毛擺動,在5～6℃間中段彎曲恢復變直,直到9℃左右時可做冷凍前彗星式對稱快速擺動并隨著溫度的升高精子可做環(huán)狀弧形軌跡運動,直到溫度升到25～35℃時精子恢復快速直線前進運動。實驗結果發(fā)現(xiàn)在14％甘油的條件下,將精子在25℃/min的速率下冷凍到-80℃,然后在100℃/min的解凍速率下得到的精子活力最高,在35℃處活力最好可達到50～60％,這與我們采用程序冷凍儀常規(guī)冷凍得到的結果完全一致,同時

5、也發(fā)現(xiàn)此條件下精子發(fā)生彎曲溫度和停止運動溫度也最低。進一步觀察在14％Gly抗凍劑條件下20條不同個體的冷凍效果,發(fā)現(xiàn)精子發(fā)生彎曲彎度、停止運動溫度與解凍后活力有極顯著意義的負相關關系(r=-0.81),這為深化低溫生物學理論研究和精子冷凍模型的建立提供重要的理論依據(jù)。目前還沒有用低溫顯微鏡來研究魚類精液冷凍的報導,本研究是第一次。
　　 斑馬魚精子超低溫冷凍的研究主要是運用低溫顯微鏡檢測精子冷凍到各個溫度段的各種冷凍速率效果和

6、分析精子發(fā)生損傷的主要溫度段。在1、25、65、100和130℃/min的速率下分別將精子冷凍到-10℃,-20℃和-30℃,檢測-10℃、-20℃和冷凍到各個溫度段后解凍到35℃處的精子膜完整性。另一組實驗是在5、25、65、100和130℃/min的速率檢測精子冷凍到-80℃后,分別檢測解凍到4℃或35℃處精子的膜完整性。精子膜的完整性通過SYBR/PI雙染色來檢測,各組實驗分別用8％DMSO和4％MEOH兩種抗凍劑。在25～130

7、℃/min速率之間冷凍到-10℃時,精子膜發(fā)生損傷率(PI％)僅為10％左右,解凍到35℃時約為15％,但是慢速率1℃/min條件下膜損傷率明顯升高,在解凍后35℃處達到28％左右。冷凍到-20℃時同樣是1℃/min慢速率膜損傷率顯著高于其他各組速率,其他各組速率之間沒有顯著性差異,在35℃處的精子膜損傷率約為20％左右。當溫度降到-30℃后解凍到35℃處的PI％結果顯示各速率下8％DMSO實驗組PI％均顯著低于4％MEOH實驗組。8％

8、DMSO在25～130℃/min速率之間沒有顯著性差異,顯著低于1℃/min,精子膜損傷率為28％左右。而4％MEOH實驗組則是慢速率1℃/min精子膜損傷率最低,但PI％也高達72％,當速率達到25℃/min以上時,精子膜損傷率達到90％以上。當精子冷凍到-80℃時無論在解凍后4℃還是35℃處檢測,均是5℃/min速率精子膜損傷率最低,8％DMSO實驗組PI％約為48％,4％MEOH實驗組為70％,當冷凍速率達到25℃/min以上時兩

9、組實驗的精子膜損傷率均高達95％以上。說明8％DMSO實驗組條件下斑馬魚精子冷凍到-30℃時25℃/min快速率精子膜損傷最小,在24％左右,當精子冷凍到-80℃時5℃/min慢速率下精子膜損傷率最小,在45％左右,速率高于25℃/min后精子膜幾乎全部發(fā)生損傷。采用25℃/min從4℃冷凍到-30℃,再以5℃/min從-30℃冷凍到-80℃,解凍后精子膜的損傷率為28％左右。通過常規(guī)冷凍法驗證兩步速率發(fā)現(xiàn)精子解凍后活力最好可以達到53