低溫冷凍對(duì)黃顙魚(yú)精子蛋白與顯微結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、精子的細(xì)胞質(zhì)膜是一種非常重要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，它能夠保護(hù)精子免受細(xì)胞外環(huán)境的刺激，膜上結(jié)合的酶及受體使細(xì)胞對(duì)外界刺激做出相應(yīng)的生理反應(yīng)，質(zhì)膜還主宰著胞內(nèi)外的物質(zhì)運(yùn)輸。質(zhì)膜在哺乳動(dòng)物精子獲能的過(guò)程中，精卵結(jié)合的受精作用過(guò)程中都是必不可少的結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)如此重要，而占細(xì)胞膜表面積一半以上的脂筏結(jié)構(gòu)則是細(xì)胞膜的核心結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜對(duì)超低溫冷凍時(shí)分敏感，說(shuō)明此時(shí)質(zhì)膜的損傷與脂筏結(jié)構(gòu)改變可能有著密切的關(guān)系。脂筏是一種富含磷脂和膽固醇位于質(zhì)膜外小頁(yè)的動(dòng)態(tài)微

2、結(jié)構(gòu)域，脂筏中含量很高的膽固醇在結(jié)構(gòu)微域中起著粘著作用，如果膽固醇被剔除，脂筏中的抗去垢劑蛋白變的很容易提取，而脂筏的結(jié)構(gòu)則被破壞變得松散，進(jìn)而使質(zhì)膜的許多功能受到破壞。質(zhì)膜在生理功能上也起著非常重要的作用，能夠保證物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸、信號(hào)與能量的傳遞以及化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行，最重要的是質(zhì)膜為多種維持生命的化學(xué)反應(yīng)提供了表面，有很多不同種類的酶定位在膜上，所以大部分生化反應(yīng)在膜表面進(jìn)行，這些生化反應(yīng)是細(xì)胞供能的主要途徑，也與精子的活力與受精能力密

3、切相關(guān)。因此，冷凍對(duì)于質(zhì)膜的損傷也涉及到對(duì)相關(guān)酶類蛋白的損傷，所以對(duì)于一些代謝相關(guān)酶類的檢測(cè)也是非常重要的。
　　本研究主要圍繞脂筏相關(guān)蛋白的改變進(jìn)行:(1)精子經(jīng)過(guò)不同的超低溫冷凍方式進(jìn)行冷凍保存，解凍后檢測(cè)鮮精和凍精中三種臘筏蛋白(Flotillin-1，F(xiàn)lotillin-2，Caveolin-1)，八種代謝相關(guān)蛋白（AKT1，Sodium potassium ATPase，PARP，ATP citrate lyase, A

4、CADM，GAPDH，Hexokinase, GLUT1）及兩種熱應(yīng)激蛋白(HSP90，HSP70)的表達(dá)量的變化情況;(2)精子在冷凍前通過(guò)膽固醇搭載環(huán)糊精藥品（Cholesterol-loaded Cyclodextri，CLC）孵育處理將膽固醇轉(zhuǎn)入精子細(xì)胞中，用甲基-β-環(huán)糊精（Methyl-beta-cyclodextrin, MβCD）剔除精子細(xì)胞中的膽固醇，檢測(cè)這兩種情況及對(duì)照組中以上幾種蛋白的表達(dá)情況，以及檢測(cè)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中

5、ATP，MDA等常規(guī)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。(3)精子解凍后檢測(cè)其表觀形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的改變。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以黃顙魚(yú)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，所涉及的實(shí)驗(yàn)方法包括:精子的超低溫冷凍分別采用泡沫船和程序冷凍儀來(lái)完成;提取蛋白采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)方法檢測(cè)幾種蛋白在鮮精和凍精以及膽固醇導(dǎo)入和剔除時(shí)的表達(dá)情況;通過(guò)利用碧云天生物技術(shù)公司的ATP檢測(cè)試劑盒(ATP Assay Kit)檢測(cè)膽固醇轉(zhuǎn)入和剔除后樣本中ATP的改變情況;通過(guò)利用碧云天生物技

6、術(shù)公司的脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)試劑盒（Lipid Peroxidation MDA Assay Kit）檢測(cè)膽固醇轉(zhuǎn)入和剔除后樣本中丙二醛(MDA)這種過(guò)氧化指標(biāo)的改變;利用蘇木精伊紅染色法檢測(cè)各組精子樣本表觀形態(tài)的改變，通過(guò)透射電鏡技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行包埋，獲得半薄及超薄切片，觀察各組樣本超顯微結(jié)構(gòu)的改變。
　　本研究以實(shí)驗(yàn)室建立并優(yōu)化的黃顙魚(yú)精子冷凍方案為基礎(chǔ)，根據(jù)脂筏蛋白在精子質(zhì)膜中的重要作用，探索黃顙魚(yú)精子在經(jīng)過(guò)冷凍保存之后脂筏

7、蛋白、代謝相關(guān)蛋白及熱應(yīng)激蛋白的改變情況。首先研究超低溫冷凍對(duì)脂筏蛋白、代謝相關(guān)蛋白及熱應(yīng)激蛋白的影響，實(shí)驗(yàn)分為鮮精組，好方案凍精組(9cm)及差方案凍精組(17cm)三組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:黃顙魚(yú)精子在冷凍過(guò)后活力顯著下降，并且好的冷凍方案(9cm)與差的冷凍方案(17cm)相比具有顯著性的優(yōu)勢(shì)(P＜0.05)。
　　三種脂筏蛋白（Flotillin-1，F(xiàn)lotillin-2及Caveolin-1）的表達(dá)水平在凍精中的表達(dá)量與鮮精

8、中相比明顯下降(P＜0.05)，兩組凍精之間的脂筏蛋白表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異（P≧0.05），較差冷凍方案凍精中的表達(dá)量最低。在代謝相關(guān)蛋白中，ATPase蛋白在精子冷凍之后表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)，但兩組凍精之間的表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異（P≧0.05）;ATP citrate lyase蛋白的表達(dá)量在鮮精組與好冷凍方案組間沒(méi)有顯著性差異(P≧0.05)，與較差冷凍方案的表達(dá)量相比有顯著差異(P＜0.05);Hexokinase蛋白在

9、鮮精中的表達(dá)量最高，兩組凍精處理組之間沒(méi)有顯著性差異（P≧0.05）;GAPDH蛋白在經(jīng)過(guò)冷凍后表達(dá)量有顯著下降(P＜0.05)，在兩組凍精之間沒(méi)有顯著性差異（P≧0.05）;GLUT1蛋白在經(jīng)過(guò)冷凍后表達(dá)量有顯著下降(P＜0.05)，在兩組凍精之間沒(méi)有顯著性差異(P≧0.05)，較差冷凍方案中的表達(dá)量最低;ACADs蛋白的表達(dá)量在鮮精組與好冷凍方案組間沒(méi)有顯著性差異（P≧0.05），與較差冷凍方案的表達(dá)量相比有顯著差異(P＜0.05)

10、;AKT1蛋白經(jīng)過(guò)冷凍之后表達(dá)量也有顯著下降(P＜0.05);PARP蛋白在經(jīng)過(guò)冷凍后表達(dá)量有顯著下降(P＜0.05)，且鮮精與兩組凍精之間的表達(dá)量都有顯著性差異（P＜0.05）;HSP90蛋白的表達(dá)量在鮮精與凍精之間有顯著性差異(P＜0.05)，且兩組凍精之間的表達(dá)量也有顯著性差異(P＜0.05);HSP70蛋白的表達(dá)量在鮮精與凍精之間有顯著性差異(P＜0.05)，在兩組凍精之間沒(méi)有顯著性差異（P≧0.05）。
　　膽固醇的導(dǎo)入

11、與剔除對(duì)精子的影響。首先，膽固醇導(dǎo)入組的活力明顯高于其它兩組（P＜0.05），膽固醇剔除組的活力明顯降低（P＜0.05）。膽固醇導(dǎo)入組的ATP含量最低，膽固醇剔除組的ATP含量最高，而對(duì)照組的ATP含量介于兩者之間，但是各個(gè)處理組之間沒(méi)有顯著性差異（P≥0.05）;膽固醇導(dǎo)入后MDA的含量明顯降低（P＜0.05），膽固醇導(dǎo)入后凍精中ROS的含量也明顯降低(P＜0.05)。膽固醇加入組中三種脂筏蛋白（Flotillin-1，F(xiàn)lotill

12、in-2及Caveolin-1）的表達(dá)量明顯高于對(duì)照及膽固出剔除的兩組凍精(P＜0.05)。膽固醇的導(dǎo)入與剔除對(duì)代謝相關(guān)蛋白都沒(méi)有明顯的保護(hù)作用，其中Sodium potassium ATPase蛋白，ATP citratelyase蛋白及PARP蛋白的表達(dá)量在幾組凍精中沒(méi)有明顯的差異（P≥0.05），GAPDH蛋白在膽固醇導(dǎo)入組表達(dá)量在凍精中最高，但是各個(gè)處理組間沒(méi)有顯著性差異（P≥0.05），膽固醇導(dǎo)入組比其它兩組凍精的表達(dá)量稍高，