多途徑組合對魚類精子超低溫冷凍損傷的挽救效應.pdf

1、目的：從膽固醇、靶向線粒體抗氧化劑MitoQ冷凍保存前導入和解凍復蘇后導入甲狀腺素這兩方面組合來研究，是否多種途徑共同作用對魚類冷凍凍精子質量有更好的挽救效應。
　　方法：DCFH-DA/PI雙染色法結合流式細胞術檢測精子細胞內ROS水平；JC-1法結合流式細胞術檢測線粒體膜電位（MMP）；ATP檢測試劑盒結合多功能酶標儀檢測ATP水平；TBA比色法結合多功能酶標儀檢測脂質過氧化產物丙二醛（MDA）；Western blot方法檢

2、測蛋白的表達。
　　結果：T3的添加方式是在精子解凍后直接加入到精子懸液中并在37℃環(huán)境中孵育，T3對黃顙魚凍精的作用濃度和孵育時間是7nM120 min時對黃顙魚解凍后精子的活力有明顯改善P＜0.05。對斑馬魚作用的濃度和時間是10 nM30 min時對斑馬魚解凍后精子的活力有改善作用。通過試劑盒檢測 T3對黃顙魚和斑馬魚凍精生化參數的影響：經過 T3處理過的凍精ATP的含量都有明顯的升高（P＜0.05）,另外處理組MDA，RO

3、S含量下降，MMP水平上升的變化也都相一致。T3對魚類凍精的UCP2蛋白的表達并沒有明顯的變化（p≥0.05）。結果顯示 T3對黃顙魚和斑馬魚凍精的精子質量有一定的改善作用。因此進一步研究多重藥物組合對魚類凍精精子質量的影響。CLC和 MitoQ的添加方式是在精子冷凍前將這兩種物質添加到精子懸液之后在室溫下孵育15 min后再進行冷凍。CLC和MitoQ對黃顙魚斑馬魚精子冷凍損傷具有明顯的改善作用已經得到證實。因此將T3，CLC和Mit

4、oQ組合方式共CON，T3，CLC，MitoQ，CLC+ T3，MitoQ+ T3，CLC+ MitoQ和 CLC+MitoQ+T38個組別。T3，CLC，MitoQ單獨作用時對黃顙魚凍精的活力都有明顯的改善作用（p＜0.05），但是兩種或三種聯(lián)合作用與單獨作用并沒有明顯的差別（p≥0.05）。單獨作用對黃顙魚凍精 MDA的產生都有明顯的下調的作用，聯(lián)合作用時同樣沒有明顯的差別。另外，單獨作用及聯(lián)合作用對黃顙魚凍精 ATP，ROS的產生

5、和MMP都沒有明顯的作用。在黃顙魚的實驗結果中顯示，T3實驗組 UCP2表達水平與其他實驗組相比較有明顯的升高，其他實驗組之間 UCP2的表達水平并沒有明顯的差別。在斑馬魚結果顯示所有實驗組間均沒有顯著性的差別（ p≥0.05）， T3+ CLC+MitoQ實驗組相較于其他組UCP2的表達量有所下降。在黃顙魚實驗結果中顯示 CLC+ MitoQ及與 T3的組合作用對 Na+/K--ATPase的表達量與其他組相比較有明顯的升高（p＜0.

6、05）。而在斑馬魚結果中T3及MitoQ+T3實驗組Na+/K--ATPase的表達量較其他組有所升高。黃顙魚是結果顯示CLC+MitoQ+T3實驗組ATP citrate lyase的表達水平與其他實驗組相比較有明顯的升高（ p＜0.05）， CLC+ MitoQ實驗組中Hexokinase的表達水平與MitoQ及MitoQ+T3實驗組相比較有明顯的升高。斑馬魚凍精實驗結果中所有處理組中ATP citrate lyase的表達水平均比

7、較穩(wěn)定， CLC實驗組中 Hexokinase的表達量較其他實驗組有所上調，其他實驗組間無明顯的差別（p≥0.05）。黃顙魚實驗結果中CLC+ T3，CLC+ MitoQ實驗組PARP的表達水平較其他組相比有所升高，在斑馬魚實驗中 PARP的表達水平均沒有明顯的差別（p≥0.05）。黃顙魚結果中 GLUT1的表達水平均沒有明顯的差異，在斑馬魚中CLC+ MitoQ及CLC+ MitoQ+ T3實驗組GLUT1表達水平較其他組相比較有所升

8、高，其他組見均沒有明顯差異（p≥0.05）。
　　結論：T3，CLC，MitoQ對黃顙魚和斑馬魚凍精的精子質量有一定的改善作用。任何兩種藥物聯(lián)合作用后對精子質量的改善作用與單獨作用時并沒有明顯差別。三種物質聯(lián)合作用與其他實驗組相比較同樣沒有明顯差別。T3對魚類凍精 UCP2的表達與其他實驗組相比較有輕微的上調作用。T3，CLC，MitoQ組合作用對黃顙魚和斑馬魚凍精的部分代謝蛋白有一定的影響，但是這些蛋白的變化對魚類凍精精子質量的