華山松大小蠹幼蟲耐寒生化與分子機制.pdf

1、冬季低溫是決定寒、溫帶昆蟲種群繁衍和種群數(shù)量的關(guān)鍵性因素，也決定著昆蟲種群的擴散、分布和時空動態(tài)等一系列生命活動。本研究以秦嶺林區(qū)持續(xù)發(fā)生的重大森林害蟲——華山松大小蠹（Dendroctonus armandi Tsai and Li）為研究對象，旨在通過研究越冬期華山松大小蠹幼蟲生理生化代謝規(guī)律，華山松大小蠹耐寒相關(guān)基因在不同低溫和時間序列下的表達差異，華山松大小蠹越冬幼蟲耐寒相關(guān)基因RNA干擾后的低溫死亡率，以及越冬期華山松大小蠹幼

2、蟲腸道真菌和細菌群落變化等，揭示越冬期華山松大小蠹幼蟲低溫脅迫耐受性，低溫脅迫下的生理生化響應(yīng)，越冬幼蟲腸道真菌和細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，以及華山松大小蠹耐寒相關(guān)基因抵御低溫環(huán)境的作用，取得以下研究結(jié)果:
　　1.通過研究華山松大小蠹越冬幼蟲過冷卻點(SCP)和低溫脅迫死亡率，結(jié)果表明華山松大小蠹越冬幼蟲過冷卻點(SCP)與環(huán)境溫度顯著正相關(guān)，在最冷月（1月）華山松大小蠹越冬幼蟲過冷卻點(SCP)達到最低值;華山松大小蠹越冬幼蟲的低溫

3、耐受性隨環(huán)境溫度的降低而逐漸增強，說明華山松大小蠹越冬幼蟲具有較強的耐寒能力，且華山松大小蠹越冬幼蟲的耐寒性可通過低溫馴化得以提高。
　　2.通過分析華山松大小蠹越冬幼蟲生理生化指標和代謝酶活性，結(jié)果表明華山松大小蠹幼蟲越冬期海藻糖、山梨糖醇、甘油含量變化與過冷卻點(SCP)顯著負相關(guān)，越冬期糖原含量大幅降低，越冬后期恢復(fù)至越冬初期水平，說明海藻糖、山梨糖醇、甘油為越冬期華山松大小蠹幼蟲體內(nèi)潛在的抗凍保護物質(zhì)，糖原為越冬期華山松大

4、小蠹幼蟲體內(nèi)重要的能源物質(zhì);越冬期間幼蟲體內(nèi)自由水轉(zhuǎn)化為結(jié)合水，總水含率變幅不大，越冬后期結(jié)合水轉(zhuǎn)化為自由水，表明華山松大小蠹越冬幼蟲具有“節(jié)水”機制，以提高蟲體耐寒性;10月～3月SOD、CAT、LDH和AchE酶活性持續(xù)減弱，POD、PK和MDH酶活性持續(xù)增強，SDH、TPS和GLK酶活性在越冬期間（10月～1月）減弱，春季活性增強后保持相對穩(wěn)定，說明華山松大小蠹主要代謝酶具有調(diào)節(jié)耐寒能力的作用。
　　3.采用實時熒光定量PC

5、R(qRT-PCR)和RNA干擾技術(shù)研究華山松大小蠹越冬幼蟲在不同低溫和時間序列下海藻糖磷酸合酶(TPS)、山梨糖醇脫氫酶(SDH)、甘油激酶(GLK)基因表達差異，結(jié)果表明越冬期華山松大小蠹幼蟲DarmTPS和DarmSDH表達量顯著上調(diào)，DarmGLK表達量下調(diào)。12月華山松大小蠹越冬蟲DarmTPS、DarmSDH和DarmGLK表達量顯著高于5月。注射DarmTPS-dsRNA、DarmSDH-dsRNA和DarmGLK-dsR

6、NA的華山松大小蠹幼蟲基因表達量顯著降低，RNA干擾后華山松大小蠹幼蟲低溫死亡率明顯升高，表明華山松大小蠹DarmTPS、DarmSDH和DarmGLK在調(diào)控幼蟲耐寒性方面發(fā)揮著十分重要的作用。
　　4.采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)研究華山松大小蠹越冬幼蟲在不同溫度梯度和時間序列下熱激蛋白（DaHSP90，DaHSP70和DasHSP）和冷休克蛋白（DarmCSP）基因表達差異，結(jié)果表明華山松大小蠹越冬幼蟲DaHS

7、P90基因?qū)浼し磻?yīng)更敏感，DaHSP70基因?qū)峒し磻?yīng)更敏感;DaHSP90和DasHSP基因在長時溫度刺激下表達量變化顯著，DaHSP70基因在短時溫度刺激下表達量變化顯著。從華山松大小蠹cDNA轉(zhuǎn)錄組序列克隆得到1條華山松大小蠹冷休克蛋白基因序列DarmCSP，該基因在越冬期間表達量呈上調(diào)趨勢，且低溫脅迫能誘導(dǎo)DarmCSP表達;同時，越夏成蟲在低溫脅迫下DarmCSP也呈上調(diào)表達，但表達量低于越冬幼蟲。
　　5.利用高通量

8、測序技術(shù)（Illumina MiSeq平臺）分析越冬期華山松大小蠹幼蟲腸道微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性和動態(tài)變化，結(jié)果表明華山松大小蠹腸道微生物群落結(jié)構(gòu)相對簡單，腸道微生物群落結(jié)構(gòu)會隨越冬期和環(huán)境溫度的變化發(fā)生改變。華山松大小蠹越冬幼蟲腸道細菌群落主要由變形菌門（主要是γ-變形菌）、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門構(gòu)成，采集于11、12月的華山松大小蠹幼蟲腸道細菌群落比采集于10月、1月的幼蟲腸道細菌群落更豐富;腸道真菌群落由接合菌門、擔子菌門和