Astrocyte elevated gene-1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及基因沉默對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、第一部分: AEG-1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響 1.目的: （1）檢測(cè)AEG-1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá) （2）研究AEG-1的表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系及其對(duì)預(yù)后的影響 （3）明確AEG-1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的定位 2.材料與方法: （1）收集病例資料：收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院接受手術(shù)并病理證實(shí)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤標(biāo)本32例，詳細(xì)記錄病人的資料，并進(jìn)行隨訪。 （2）研究AE

2、G-1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織的表達(dá)：免疫組織化學(xué)法。 （3）明確AEG-1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的定位：免疫熒光標(biāo)記法。 3.結(jié)果: （1）AEG-1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中是高表達(dá)的，75％（24/32例）標(biāo)本為陽(yáng)性表達(dá)。 （2）對(duì)32例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的臨床資料進(jìn)行x2檢驗(yàn)，研究AEG-1與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。年齡<1歲的患者中AEG-1陽(yáng)性率為37.5％（3/8），年齡≥1歲患者中AEG-1陽(yáng)性率為87.5％（

3、21/24），二者相比有顯著性差異（P=0.012），年齡≥1歲組AEG-1表達(dá)水平高于年齡<1歲組；男性患者中AEG-1陽(yáng)性率為77.8％（14/18），女性患者中AEG-1陽(yáng)性率為71.4％（10/14），二組無(wú)顯著性差異（P=0.703）；原發(fā)部位為腎上腺的患者中AEG-1陽(yáng)性率為78.9％（13/19），發(fā)病部位為腎上腺以外的患者中AEG-1陽(yáng)性率為69.2％（11/13），二組無(wú)顯著性差異（P=0.420）；處于疾病早期（Ea

4、rly stage）（Ⅰ+Ⅱ+Ⅳs）的患者中AEG-1陽(yáng)性率為50％（5/10），處于進(jìn)展期（Advanced stage）（Ⅲ+Ⅳ）患者中AEG-1陽(yáng)性率為90％（18/20），二組相比有顯著性差異（p=0.03），進(jìn)展期AEG-1表達(dá)水平高于早期；根據(jù)國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤病理分型，組織結(jié)構(gòu)良好型（Favourable histology，F(xiàn)H）的患者中AEG-1陽(yáng)性率為58.8％（10/17），組織結(jié)構(gòu)不良型（Unfavourable

5、histology，UFH）患者中AEG-1陽(yáng)性率為93.3％（14/15），二組相比有顯著性差異（P=0.041），UFH患者AEG-1表達(dá)水平高于FH。 （3）Spearman相關(guān)性分析，AEG-1表達(dá)與患者的發(fā)病年齡（r=0.404，P=0.022）、臨床分期（r=0.447，P=0.010）、病理分型（r=0.389，P=0.024）呈正相關(guān)。 （4）對(duì)32例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行單因素Kaplan-Meier分析，再

6、用Log-rank檢驗(yàn)兩組生存率的統(tǒng)計(jì)意義，研究與神經(jīng)母細(xì)胞瘤預(yù)后相關(guān)的因素。 （5）Cox多因素分析結(jié)果，國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤病理分型是影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤病人預(yù)后的獨(dú)立因素（P=0.022）；AEG-1的表達(dá)（P=0.176），年齡（P=0.247），臨床分期（P=0.694）不是影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤病人預(yù)后的獨(dú)立因素。 （6）AEG-1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜表達(dá)，在細(xì)胞核內(nèi)沒(méi)有AEG-1的表達(dá)。 4.結(jié)論:

7、（1）AEG-1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中是高表達(dá)的，75％（24/32例）標(biāo)本為陽(yáng)性表達(dá)。 （2）AEG-1的表達(dá)在不同的發(fā)病年齡、臨床分期、病理類型的患者之間有顯著性差異，而在不同的性別、不同發(fā)病部位的患者之間沒(méi)有顯著性差異。 （3）Spearman相關(guān)性分析，AEG-1表達(dá)與患者的發(fā)病年齡、臨床分期、病理分型呈正相關(guān)。 （4）對(duì)32例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行單因素Kaplan-Meier分析，再用Log-rank檢驗(yàn)兩組生

8、存率的統(tǒng)計(jì)意義。AEG-1的表達(dá)、病人的發(fā)病年齡、臨床分期和病理分型對(duì)患者預(yù)后的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而病人的性別和起病的部位對(duì)患者的預(yù)后沒(méi)有影響。 （5）Cox多因素分析結(jié)果，病理分型是影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤病人預(yù)后的獨(dú)立因素。 （6）AEG-1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜表達(dá)，在細(xì)胞核內(nèi)沒(méi)有AEG-1的表達(dá)。 第二部分:慢病毒介導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞AEG-1基因沉默 目的: （1）構(gòu)建AEG-1 RNA干

9、擾慢病毒載體 （2）篩選AEG-1基因沉默的細(xì)胞株 （3）比較AEG-1基因沉默的效果 材料與方法: （1）AEG-1 RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建：采用Invitrogen公司的BLOCK-iTLentiviral RNAi Expression System，構(gòu)建入門(mén)克隆和病毒包裝目的質(zhì)粒。 （2）RNA干擾慢病毒的生產(chǎn)和滴度測(cè)定：四種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT的方式生產(chǎn)病毒，病毒功能滴度測(cè)定用轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)，分

10、子滴度測(cè)定用定量PCR技術(shù)。 （3）基因沉默細(xì)胞株的篩選：慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)M17和SK-N-SH細(xì)胞后用Blasticidin篩選，建立AEG-1基因沉默細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株。 （4）細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：用Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，評(píng)價(jià)RNAi效果。 （5）AEG-1 mRNA表達(dá)水平的分析：定量RT-PCR。 （6）AEG-1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)：Western Blot分析。 3.結(jié)果:

11、 （1）成功構(gòu)建AEG-1RNAi入門(mén)質(zhì)粒，兩個(gè)針對(duì)不同序列的RNAi質(zhì)粒均有顯著的干擾效果，AEG-1mRNA抑制效果分別達(dá)53.7％和61.1％。 （2）包裝產(chǎn)生的濃度為2×1010copies/ml的Lenti6-AEG-1和Lenti6-NS轉(zhuǎn)導(dǎo)M17、SK-N-SH細(xì)胞的功能滴度分別為：1.8×106TU/ml、1.2×106TU/ml和1.7×106TU/ml、1.2×106TU/ml。 （3）成功篩選出AEG

12、-1基因沉默的M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）細(xì)胞，同時(shí)建立非特異性對(duì)照細(xì)胞M17/NS和SK-N-SH/NS。 （4）M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）的AEG-1mRNA水平約下降80％，M17/NS和SK-N-SH/NS的AEG-1mRNA水平與親本細(xì)胞相比無(wú)明顯改變；M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）的AEG-1蛋白質(zhì)水平約下降90％。 4.

13、結(jié)論: （1）成功構(gòu)建AEG-1 shRNA表達(dá)質(zhì)粒，并比較針對(duì)不同靶序列的RNAi質(zhì)粒的效果，確定RNAi效果較好的靶序列。 （2）采用BLOCK-iT慢病毒RNA干擾系統(tǒng)，成功構(gòu)建并包裝生產(chǎn)較高滴度的慢病毒載體。 （3）應(yīng)用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)加Blasticidin篩選的方式，成功建立AEG-1基因穩(wěn)定沉默的M17和SK-N-SH細(xì)胞及非特異性病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。 （4）定量RT-PCR和Western Blot分析結(jié)果表明

14、篩選細(xì)胞AEG-1基因mRNA水平顯著抑制，蛋白質(zhì)水平明顯下降。 第三部分:AEG-1基因沉默對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生物學(xué)行為的影響 1.目的: （1）觀察AEG-1基因沉默對(duì)細(xì)胞增殖的影響 （2）分析AEG-1基因沉默對(duì)細(xì)胞周期的影響 （3）探討AEG-1基因沉默對(duì)凋亡的影響 （4）研究AEG-1基因沉默對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的影響 （5）分析AEG-1基因沉默對(duì)細(xì)胞化療敏感性的影響 2.材料與

15、方法: （1）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)AEG-1基因沉默對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 （2）細(xì)胞周期分析：用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞DNA含量，Modtif軟件分析細(xì)胞周期。 （3）細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：采用Annexin-V和PI雙染流式細(xì)胞儀分析AEG-1基因沉默對(duì)細(xì)胞的凋亡情況的影響。 （4）細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)：Transwell侵襲試驗(yàn)。 （5）化療敏感性實(shí)驗(yàn)：MTT法測(cè)定細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的差異。

16、 3.結(jié)果: （1）AEG-1基因沉默細(xì)胞增殖分別降低45.1％，57.4％，明顯慢于親本細(xì)胞，克隆形成率分別降低43.5％，56.7％；非特異性對(duì)照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖未受明顯影響。 （2）AEG-1基因沉默細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞增加29.3％，26.9％，與親本細(xì)胞相比有顯著性差異。 （3）AEG-1基因沉默細(xì)胞的凋亡率增加7.5％和6.4％。 （4）AEG-1基因沉默的細(xì)胞穿過(guò)膜的能力降低56.8％，50.0