Sox2在神經(jīng)母細胞瘤中的表達及其對神經(jīng)母細胞瘤干細胞生物學特性的影響.pdf

1、研究背景與目的
　　 神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma，NB)是小兒最常見的顱外惡性實體腫瘤，占小兒所有惡性腫瘤的10％，惡性程度高，多數(shù)患兒預后不良。盡管近年來手術(shù)結(jié)合化療的綜合療法在治療NB方面取得了很大的進步，但是其發(fā)病率和死亡率仍然較高。因此，深入研究NB的發(fā)生、發(fā)展機理至關重要。神經(jīng)母細胞瘤是一種胚胎性腫瘤，胚胎期神經(jīng)嵴細胞發(fā)育分化受阻是神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生的主要原因，亦是衡量神經(jīng)母細胞瘤惡性程度及影響預后的主要危

2、險因素。Sox2是一種胚胎干細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，是調(diào)控胚胎發(fā)育的關鍵因子，在早期胚胎發(fā)育過程中對維持胚胎干細胞多潛能性和自我更新的能力具有關鍵性的調(diào)控作用。故我們試圖探索Sox2基因在神經(jīng)母細胞瘤中的表達及其對神經(jīng)母細胞瘤干細胞生物學特性的影響，探討其在神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。
　　 材料與方法
　　 1.Sox2在神經(jīng)母細胞瘤中的表達：采用RT-PCR、Real.time PCR、Western blot及

3、免疫組織化學等方法檢測Sox2在神經(jīng)母細胞瘤組織和瘤旁組織中的表達情況，并結(jié)合臨床資料，分析其表達與臨床病理參數(shù)的關系。
　　 2.Sox2對神經(jīng)母細胞瘤干細胞生物學特性的影響：采用RT-PCR檢測Sox2在神經(jīng)母細胞瘤BE(2)-C細胞中的表達情況。利用慢病毒載體感染BE(2)-C細胞構(gòu)建Sox2高表達[BE(2)-C-Sox2]和低表達[BE(2)-C-shRNA]細胞，然后采用CCK-8活細胞數(shù)檢測和流式細胞儀細胞周期分析

4、，探討Sox2對BE(2)-C細胞增殖能力的影響。維甲酸(RA)和5-溴2’-去氧尿甙(BrdU)干預細胞誘導分化后采用Western blot檢測細胞標志蛋白的表達差異，分析Sox2對BE(2)-C細胞分化能力的影響。平板克隆和軟瓊脂克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數(shù)目和克隆形成率，分析Sox2對BE(2)-C細胞克隆形成能力的影響。裸鼠成瘤實驗分析Sox2對BE(2)-C細胞體內(nèi)成瘤能力的影響。
　　 3.基因芯片檢測Sox2下

5、調(diào)時神經(jīng)母細胞瘤干細胞基因表達譜變化：應用基因表達譜芯片檢測BE(2)-C細胞和BE(2)-C-shRNA細胞基因表達譜情況，篩選差異基因，并采用Real-time PCR檢測驗證相關差異表達的基因。
　　 結(jié)果
　　 1.Sox2在神經(jīng)母細胞瘤中的表達：RT-PCR結(jié)果顯示在神經(jīng)母細胞瘤組織中可檢測到Sox2基因mRNA水平表達。免疫組織化學染色結(jié)果顯示Sox2主要在腫瘤細胞核中表達，而瘤旁組織中表達呈陰性。Real-

6、time PCR及Western blot結(jié)果均顯示神經(jīng)母細胞瘤組織中Sox2的表達水平明顯高于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)Sox2在高分期腫瘤中的表達水平高于低分期腫瘤(P<0.05)，且未經(jīng)化療的腫瘤其Sox2的表達水平高于經(jīng)化療的腫瘤(P<0.05)。Sox2在神經(jīng)母細胞瘤中的表達水平與性別、年齡、腫瘤部位、大小、病理分型等參數(shù)無相關性(均P>0.05)。
　　 2.Sox2對神經(jīng)母細胞瘤干細

7、胞生物學特性的影響：RT-PCR結(jié)果顯示在神經(jīng)母細胞瘤BE(2)-C細胞系中可檢測到Sox2基因mRNA水平表達。利用慢病毒載體感染BE(2)-C細胞成功構(gòu)建Sox2高表達[BE(2)-C-Sox2]和低表達[BE(2)-C-shRNA]穩(wěn)定細胞。CCK-8活細胞數(shù)檢測顯示72h時BE(2)-C-Sox2細胞的AV值(1.465±0.046)高于BE(2)-C細胞(1.01±0.018)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而BE(2)-

8、C-shRNA細胞的AV值(0.912±0.020)低于BE(2)-C細胞(1.201±0.018)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。流式細胞儀細胞周期分析顯示BE(2)-C-Sox2組S期細胞百分比(55.2±4.3％)高于BE(2)-C組細胞(38.6±3.5％)，BE(2)-C-shRNA組S期細胞百分比(21.8±5.7％)低于BE(2)-C組細胞，三組組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而三組細胞G0/G1期細胞百分比

9、的比較情況呈現(xiàn)出相反的結(jié)果；BE(2)-C-Sox2、BE(2)-C及BE(2)-C-shRNA組的細胞增殖指數(shù)分別為65.2±5.6％、36.3±2.8％、51.7±4.6％，三組組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RA或BrdU干預后Western blot檢測細胞標志蛋白(Peripherin、NF-68、Vimentin、S-100)顯示，經(jīng)RA或BrdU干預的BE(2)-C-Sox2細胞其標志蛋白表達量低于經(jīng)同種藥物干預

10、的BE(2)-C細胞和空載體細胞(P<0.05)；而經(jīng)RA或BrdU干預的BE(2)-C-shRNA細胞其標志蛋白表達量高于經(jīng)同種藥物干預的BE(2)-C細胞和空載體細胞(P<0.05)。平板克隆形成實驗顯示BE(2)-C-Sox2細胞的克隆形成數(shù)目(103±18)和克隆形成率(20.6％)均高于BE(2)-C細胞(75±12，15％)，而BE(2)-C-shRNA細胞的克隆形成數(shù)目(42±7)和克隆形成率(8.4％)均低于BE(2)-

11、C細胞，三組組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。軟瓊脂克隆形成實驗未成功，細胞均死亡。裸鼠成瘤實驗顯示BE(2)-C-Sox2接種組腫瘤的生長速度和體積均大于BE(2)-C接種組，而BE(2)-C-shRNA接種組腫瘤的生長速度和體積均低于BE(2)-C接種組，三組組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3.基因芯片檢測Sox2下調(diào)時神經(jīng)母細胞瘤干細胞基因表達譜變化：Sox2基因表達下調(diào)時基因表達譜芯片篩得差異表

12、達的基因有596條，其中差異顯著的基因有FMN1、GFRA2、HIST1H2BK、CARTPT、AHNAK2、PLP2、TSPAN8、TIMP2、EPO和PRR11等。經(jīng)Real-time PCR驗證，證實芯片篩選的結(jié)果可靠。
　　 結(jié)論
　　 1.Sox2在神經(jīng)母細胞瘤(組織和細胞)中存在表達，其表達水平與腫瘤的臨床分期有一定相關性，與性別、年齡等參數(shù)無明顯相關性。化療藥物對Sox2的表達有抑制作用。
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