神經(jīng)母細(xì)胞瘤中Trks基因的表達(dá)及K252a對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用.pdf

1、前言：神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma，NB)是兒童最常見的腫瘤之一，它起源于神經(jīng)嵴的交感神經(jīng)鏈?；颊卟∏轭A(yù)后評判部分取決于就診時患者的年齡及其腫瘤分期。NB腫瘤富有興趣的一個特征是某些嬰兒播散性腫瘤能夠在未經(jīng)治療的情況下自行消退。多數(shù)研究表明某些腫瘤標(biāo)記物可能和NB腫瘤的分期及其預(yù)后相關(guān)。目前認(rèn)為Trks原癌基因的表達(dá)在調(diào)節(jié)NB腫瘤的生物學(xué)特征方面具有重要性作用。 同源性神經(jīng)營養(yǎng)素(Neurotrophins，NTs)

2、家族包括神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)及神經(jīng)營養(yǎng)素-4/5(NT-4/5)。人們近來已經(jīng)克隆出來三種酪氨酸激酶受體(Tyrosinekinaserceptors，Trks)基因，即TrkA、TrkB及TrkC基因各自分別編碼NGF、BDNF及NT-3的對應(yīng)性受體。NTs通過粘附和激活跨膜Trks受體激酶而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞的作用。因此Trks受體激酶在調(diào)節(jié)正常和腫瘤神經(jīng)細(xì)胞的存活、生長及分化

3、中具有相當(dāng)重要的作用。Trks激酶抑制劑作為NB腫瘤治療的探索正是基于此種假說，即NB腫瘤的細(xì)胞生長是通過NT/Trk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來維持腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。 為了評估NB腫瘤中Trks基因表達(dá)的狀況及其意義，我們分別采用免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，對NB腫瘤組織中這些受體激酶的表達(dá)水平進(jìn)行半定量檢測和評價，旨在探討這些Trks基因表達(dá)和NB腫瘤的分化成熟、腫瘤分期及預(yù)后評估的關(guān)系。我們認(rèn)為普通醫(yī)院的臨床實驗室比較容易采

4、納這些方法以便開展對NB患者進(jìn)行分子和遺傳學(xué)的評價。此外，我們還研究了K252a在體外對神經(jīng)母細(xì)胞瘤SY5Y細(xì)胞的形態(tài)和生長的影響，并對其作用機(jī)理進(jìn)行了初步性探討，為開展K252a類衍生物在NB移植模型中的抗腫瘤研究奠定了良好的工作基礎(chǔ)。 方法： 一、臨床部分 1、臨床資料：本組資料來源于我院自1997年至2003年已經(jīng)治療的40例患者的腫瘤組織，其中神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)34例、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤(GNB)2例及

5、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤(GN)4例。全部腫瘤患者均經(jīng)術(shù)后病理所證實?；颊叽_診年齡為2月-14歲，平均年齡為3.2歲。根據(jù)Evans標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行NB的腫瘤分期，其中Ⅰ期5例、Ⅱ期6例、ⅣS期3例、Ⅲ期7例及Ⅳ期13例。 2、免疫組化：采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化染色技術(shù)對40例NB腫瘤組織中Trks受體激酶的表達(dá)進(jìn)行檢測。本組全部腫瘤組織統(tǒng)一進(jìn)行Trks受體免疫組化染色的半定量分級。采用0-5的六級評定分類法：0級為組織沒有

6、染色；1級為組織微量染色；2級為偶見細(xì)胞染色；3級為細(xì)胞少量染色；4級為細(xì)胞大量染色；5級為細(xì)胞極強(qiáng)染色。每個切片中隨機(jī)選取10個區(qū)域，高倍鏡下觀察和評級，隨后計算這10個高倍視野區(qū)的平均分級值。 3、RT-PCR：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)對27例NB組織中Trks基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行半定量檢測。本組全部NB組織中Trks基因的表達(dá)，通過密度分析法測定各種靶基因產(chǎn)物與內(nèi)參照基因產(chǎn)物β-actin的比值，半定量

7、分析這些靶基因的相對表達(dá)水平。我們根據(jù)其比值差異的范圍而采用三級分類法：＜0.5為不表達(dá)，0.5-1.0為低表達(dá)，＞1.0為高表達(dá)。 二、基礎(chǔ)部分 1、細(xì)胞培養(yǎng)：人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤SY5Y細(xì)胞株經(jīng)過復(fù)蘇處理后，放置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃含有5％CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)以維持細(xì)胞生長。 2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體Lipofectamine介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)對SY5Y細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將本組轉(zhuǎn)染pBPSTR1-

8、TrkA和pBPSTR1質(zhì)粒的細(xì)胞，分別命名為SY5Y-TrkA實驗組和SY5Y-Vec空載體組，而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則命名為SY5Y對照組。 3、TrkA基因表達(dá)的鑒定：采用RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞中TrkAmRNA的表達(dá)水平，通過密度分析法檢測TrkA基因和內(nèi)參照β-actin基因產(chǎn)物的比值。 4、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：三組細(xì)胞株培養(yǎng)一周后，經(jīng)1.25％戊二醛固定及熒光染料Annexin-V染色，采用熒光顯微鏡在藍(lán)色激發(fā)光(波

9、長488nM)下觀察并照相。 5、細(xì)胞存活分析：將三組細(xì)胞按照3×104個/孔接種于96孔板，孵化全程六天后分別收獲細(xì)胞，采用MTT技術(shù)按照標(biāo)準(zhǔn)方法檢測存活細(xì)胞數(shù)量。酶標(biāo)儀測定波長550nM的吸光度值，DMSO處理的對照組的吸光度值按照100％計算，則實驗管細(xì)胞增殖率(％)=實驗管數(shù)值/對照管數(shù)值×100％。 結(jié)果： 一、臨床部分 1、Trks受體的表達(dá)與分化成熟：在NB小葉的較好組織結(jié)構(gòu)中，低分期組要較

10、高分期組的腫瘤組織具有更強(qiáng)的T~kA及TrkC受體表達(dá)的免疫組化染色反應(yīng)。TrkA及TrkC受體表達(dá)的染色反應(yīng)和分化成熟的程度呈現(xiàn)出向心性逐漸增強(qiáng)的趨勢。全部2例GNB及4例GN標(biāo)本組織也都對TrkA及TrkC抗體呈現(xiàn)出明顯的強(qiáng)陽性染色反應(yīng)。全部標(biāo)本組織中僅見4例出現(xiàn)NB細(xì)胞對TrkB抗體的陽性染色反應(yīng)。 2、Trks受體表達(dá)的免疫組化分級：TrkA受體的免疫組化分級值在存活組與死亡組之間的比較具有顯著性差異(P＜0.01)，而

11、在低分期組與高分期組之間的比較也具有顯著性差異(P＜0.01)，但TrkB或TrkC受體的免疫組化分級值在上述各組之間的比較則均無顯著性差異(P＞0.05)。34例NB患者TrkA受體的免疫組化分級值伴隨著腫瘤分期的增高而呈現(xiàn)逐漸性降低的趨勢。 3、Trks基因mRNA的表達(dá)率：TrkA的高表達(dá)率及總表達(dá)率在低分期組均明顯大于高分期組(p＜0.05)，而其高表達(dá)水平與患者2年存活率之間具有明顯的相關(guān)性(p＜0.01)。TrkB的

12、高表達(dá)率及總表達(dá)率在高分期組均明顯大于低分期組(p＜0.05)。TrkC的表達(dá)通常伴有TrkA的表達(dá)，而這兩者的共同表達(dá)率在低分期組則明顯大于高分期組(p＜0.05)，但它們的表達(dá)之間并不存在著關(guān)聯(lián)性趨勢。 二、基礎(chǔ)部分 1、K252a對SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響：DMSO處理的SY5Y細(xì)胞可以保持均勻的扁片狀生長。K252a處理的其它三組細(xì)胞中，SY5Y和SY5Y-Vec細(xì)胞均見胞體增大、聚集成簇團(tuán)狀且軸突明顯延伸，但SY

13、5Y-TrkA細(xì)胞則呈現(xiàn)散在性分布且胞體縮小及變形改變。 2、K252a對SY5Y細(xì)胞增殖的影響：將用DMSO處理的SY5Y對照組細(xì)胞的增殖率按100％計算，而經(jīng)K252a處理的其它三組細(xì)胞的增殖率則分別為：SY5Y細(xì)胞組為127±14，SY5Y-Vec空載體組為123±15，SY5Y-TrkA轉(zhuǎn)染組為65±8。除了SY5Y細(xì)胞組和SY5Y-Vec空載體組的均數(shù)比較無顯著性差異外，其它各組細(xì)胞的均數(shù)組間比較均有顯著性差異(P＜0

14、.01)。 結(jié)論： 1、采用免疫組化技術(shù)可以檢測NB組織中Trks受體蛋白的表達(dá)及NB細(xì)胞的分化成熟度。 2、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)可以半定量檢測NB組織中Trks基因mRNA的表達(dá)。 3、Trks基因的表達(dá)對NB患者的腫瘤分期及其預(yù)后評轱可能具有重要性價值。 4、K252a能夠促進(jìn)不表達(dá)TrkA基因的SY5Y細(xì)胞的生長及其分化。 5、K252a能夠抑制表達(dá)TrkA基因的SY5Y-Tr