噬菌體展示候選甲型流感病毒和乙型流感病毒聯(lián)合疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究.pdf

1、流行性感冒是一種非常嚴(yán)重的全球性的呼吸道傳染病。在流感流行期間，全球有10-20％的人口感染流感病毒，每年造成三百萬至五百萬嚴(yán)重病例和250，000至500，000例死亡。對流感的預(yù)防尚無非常有效的方法，接種疫苗是目前最有效的途徑。血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸(NA)是存在于病毒表面易感的大型糖蛋白，且具有強(qiáng)的免疫原性，是非常好的疫苗抗原?，F(xiàn)在市場上的疫苗都將血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸(neuraminidase，

2、NA)作為主要或唯一病毒抗原。血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸(NA)基因的改變和重排，是通過疫苗接種控制流感流行的主要障礙。因此，流感病毒能夠重復(fù)感染并使得每年需要新的疫苗進(jìn)行免疫接種。開發(fā)基于流感病毒不變區(qū)域，能產(chǎn)生廣譜的交叉免疫反應(yīng)的普適性流感疫苗是迫切需要的。 由病毒基因編碼的M2蛋白是一個四聚體離子通道，在病毒顆粒中少量表達(dá)或不表達(dá)，但卻在被病毒感染的細(xì)胞表面大量表達(dá)。M2蛋白膜外區(qū)(M2e)由24個氨基酸殘基組成，并且不發(fā)生

3、基因漂移和變異。自1918年西班牙流感大流行至今，雖然其間發(fā)生了無數(shù)次的流感流行和三次全球性大流行，M2e序列基本保持不變。研究表明，不同構(gòu)造形式的基于M2e的疫苗能夠提供保護(hù)性免疫。乙型流感病毒的BM2蛋白由109個氨基酸殘基組成，是乙型流感病毒編碼的血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸(NA)和NB糖蛋白之外的第四個膜內(nèi)在蛋白。BM2具有離子通道活性，熒光顯微鏡顯示BM2表達(dá)于為感染細(xì)胞表面。雖然BM2在乙型流感病毒生活周期中有著自己特有的功能

4、，但是BM2還是被認(rèn)為具有和M2蛋白在甲型流感病毒中相似的功能，可能能作為通用乙型流感病毒的候選表位。 流感病毒研究中常用的是小鼠動物模型不能在小鼠間傳播，而豚鼠不但能對未經(jīng)適應(yīng)性改變的流感病毒敏感，流感病毒也能在豚鼠中以飛沫傳播，因此豚鼠可以作為流感病毒傳染研究的新動物模型。噬菌體疫苗是以噬菌體作為疫苗載體，將特異表位展示在噬菌體顆粒表面，構(gòu)建成不同表位特異的噬菌體疫苗，具有病毒樣顆粒特性，能引發(fā)強(qiáng)的針對表位的特異性免疫應(yīng)答。

5、鼻腔免疫是近年發(fā)展起來新的粘膜免疫途徑，它通過抗原在鼻粘膜的釋放，誘導(dǎo)系統(tǒng)和粘膜免疫應(yīng)答。研究表明，由T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞以及包括M細(xì)胞的隱窩吸收上皮細(xì)胞組成的鼻粘膜相關(guān)淋巴組織(nose associated lymphoid tissue，NAIT)，是鼻腔免疫的誘導(dǎo)部位。殼聚糖是一個新型的緩控釋疫苗呈遞系統(tǒng)載體，能安全而有效地促進(jìn)鼻腔吸收微球疫苗。本文利用基因重組將M2e&BM2多表位基因片斷與T7 10B衣殼蛋白基因融合構(gòu)建

6、噬菌體候選疫苗，PCR鑒定為陽性的噬菌體候選疫苗擴(kuò)增后用甲醛滅活。用10<'10>pfu劑量的噬菌體微球聯(lián)合流感候選疫苗經(jīng)鼻腔免疫豚鼠，并用10<'3>pfu的H3N2、H1N1和B型流感病毒分別對經(jīng)候選疫苗免疫和未經(jīng)候選疫苗免疫的豚鼠進(jìn)行攻擊，分別檢測上呼吸道(upstream respiratory tract，URT)和肺部流感病毒滴度，對比研究候選疫苗對病毒感染的保護(hù)作用。 ELISA檢測血清IgG水平發(fā)現(xiàn)，噬菌體微球聯(lián)

7、合流感候選疫苗具有特異性免疫原性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對M2e和BM2的特異性抗體。對病毒感染的豚鼠呼吸道內(nèi)的病毒滴度檢測表明，噬菌體微球聯(lián)合流感候選疫苗對豚鼠的全呼吸道具有抗H3N2和H1N1的保護(hù)作用；對乙型流感病毒感染的豚鼠上呼吸道候選疫苗無保護(hù)效果，肺部有一定的保護(hù)效果。 因此，(1)構(gòu)建的噬菌體微球聯(lián)合流感候選疫苗經(jīng)鼻腔免疫能有效誘導(dǎo)特異性體液免疫，產(chǎn)生特異性抗體(M2e&BM2)；(2)候選疫苗誘導(dǎo)的M2e抗體對感染H3N2