甲型流感病毒NP基因真核表達載體的構建及其免疫效果研究.pdf

1、目的: 流行性感冒(簡稱流感)是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒分別引起的急性呼吸道感染，其中甲型流感病毒在自然界中廣泛分布，常以流行形式出現(xiàn)，可引起世界性流感大流行，對人類健康和世界經(jīng)濟造成巨大影響。流感病毒在自然界中不僅能經(jīng)常發(fā)生抗原性漂移，而且也能發(fā)生同型毒株間基因片段的重配，這樣就造成了流感疫苗的時效性。因此，研制具有交叉保護能力的流感疫苗對于有效防止流感的發(fā)生和流行具有重要意義。 甲型流感病毒RNA分

2、為8個節(jié)段，其中第5節(jié)段編碼其核衣殼蛋白(nucleoprotein，NP)。NP參與病毒復制周期的多個階段，影響病毒的轉錄、復制、裝配及轉運功能；此外，NP也是細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic Tlymphocytes.CTL)識別的主要抗原，CTL通過識別MHC-I類分子遞呈的核蛋白抗原肽而清除感染的流感病毒，因而能對不同亞型的病毒株產(chǎn)生交叉保護性。 本研究旨在構建pcDNA3.1(+)/NP的核酸疫苗，觀察其在真核細

3、胞中的表達，并在機體水平上研究其單獨應用及與本室成功構建的pcDNA3.1(+)/HA聯(lián)合應用的抗流感病毒免疫效果。 方法: 1.甲型流感病毒NP基因DNA疫苗的構建：從流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)感染的雞胚尿囊液中提取病毒RNA，用RT-PCR技術擴增NP基因，并將擴增的NP基因克隆入真核表達載體pcDNA 3.1(+)，構建NP基因的真核表達載體-pcDNA3.1(+)/NP。 2.pcDNA3.

4、1(+)/NP的初步表達：將pcDNA3.1(+)/NP質粒DNA用脂質體介導法轉染HEK293細胞，然后用免疫熒光檢測重組質粒的表達情況。再將pcDNA3.1(+)/NP質粒DNA經(jīng)肌肉注射免疫動物，免疫組化技術檢測NP基因在肌細胞的表達及持續(xù)時間。 3.pcDNA3.1(+)/NP質粒DNA的免疫效果研究：將pcDNA3.1(+)/NP質粒DNA采用DNA疫苗的肌肉注射方式免疫動物，通過免疫檢測技術觀察其對機體的抗流感病毒免

5、疫應答；并用同一亞型流感病毒攻擊免疫小鼠，觀察肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率等指標；最后用不同亞型的流感病毒攻擊免疫小鼠，觀察保護率。綜合評價pcDNA3.1(+)/NP作為DNA疫苗的保護效果，和與pcDNA3.1(+)/HA聯(lián)合應用的免疫效果。 結果: 1.經(jīng)RT-PCR技術從流感病毒RNA中擴增到.NP基因，經(jīng)酶切后插入pcDNA3.1(+)，構建成pcDNA3.1(+)/NP。該重組載體經(jīng)限制性內切酶酶切、：PCR及序列測

6、定等鑒定，證實pcDNA3.1(+)/NP構建成功。 2.pcDNA3.1(+)/NP質粒DNA轉染ItEK293細胞后，免疫熒光結果顯示所轉染的細胞有較強的綠色熒光信號。給實驗動物肌肉內注射pcDNA3.1(+)/NP質粒DNA后，在實驗觀察的所有時間點均可觀測到NP蛋白的表達。 3.淋巴細胞增殖試驗表明，動物接種pcDNA3.1(+)/NP質粒DNA后，在流感病毒抗原的刺激下，能夠誘導有效的淋巴細胞增殖反應。流感病毒

7、攻擊后肺指數(shù)等指標顯示，pcDNA3.1(+)/NP質粒DNA與pcDNA3.1(+)/HA質粒DNA聯(lián)合使用對抑制肺病變程度的效果顯著。被pcDNA3.1(+)/Np質粒DNA免疫的動物對同亞型流感病毒攻擊的保護率為50％，對不同亞型流感病毒攻擊的保護率為37.5％，而且與pcDNA3.1(+)/HA質粒DNA聯(lián)合使用后可明顯提高保護率。 結論： 1.成功構建了甲型流感病毒NP基因的真核表達載體-pcDNA3.1(+)

8、/NP。 2.免疫熒光技術證實了NP基因能夠在哺乳動物細胞中表達；實驗動物肌肉注射該重組質粒DNA后可在肌細胞內檢測到目的基因表達。 3.淋巴細胞增殖試驗證實，pcDNA3.1(+)/NP的質粒DNA免疫動物后能有效誘導機體產(chǎn)生抗流感病毒的細胞免疫。pcDNA3.1(+)/NP的質粒DNA免疫動物后，對同一亞型和/或不同亞型流感病毒的攻擊都能提供有效的保護作用，與pcDNA3.1(+)/HA聯(lián)合應用可明顯提高保護效果。