甲型流感病毒核蛋白基因真核質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、流感病毒是嚴(yán)重危害人類的呼吸道傳染病原體,曾多次引起世界流感大流行。它是單鏈負(fù)鏈RNA病毒,其基因由8段RNA組成編碼11種蛋白:血凝素HA,神經(jīng)氨酸酶NA,基質(zhì)蛋白M1,離子通道蛋白M2,非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2,核蛋白(nucleoprotein,NP),凋亡前體蛋白PB1-F2和RNA依賴性RNA聚合酶PA,PB1和PB2等。核蛋白NP為流感病毒顆粒的重要組成部分,由498個(gè)氨基酸組成分子質(zhì)量約56 KD的多肽,是甲型流感病毒RN

2、A的第5節(jié)段基因編碼的RNA結(jié)合蛋白,與多聚酶蛋白及病毒單鏈的RNA相互作用形成螺旋對稱的RNP復(fù)合體。RNP復(fù)合體,與依賴RNA的多聚酶一起成為病毒基因組復(fù)制與轉(zhuǎn)錄必不可少的結(jié)構(gòu)。NP也是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識(shí)別的主要抗原。所以甲型流感病毒核蛋白基因可以作為防治流感病毒的一個(gè)主要靶點(diǎn).
　　 目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)核蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,并檢測Hela細(xì)

3、胞內(nèi)NP的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究核蛋白的功能和相關(guān)理化作用及對核蛋白的影響奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫已發(fā)表的甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(GenBank/NCB,GI:8486129)毒株的核蛋白基因全長序列用Primer Primier5軟件設(shè)計(jì)兩條NP的特異引物并加酶切點(diǎn),用特異引物從甲型流感病毒cDNA中采用PCR技術(shù)克隆出NP基因,酶切后,將其插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.

4、1(+)。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/N P經(jīng)酶切、PCR、測序鑒定。將構(gòu)建好的pcDNA3.1(+)/N P用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,用甲型流感病毒檢測試劑盒(Flu A Rapid Test Kit)檢測檢測Hela細(xì)胞內(nèi)外NP的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 經(jīng)PCR克隆出的甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)NP基因,經(jīng)酶切連接后構(gòu)建一個(gè)新的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/N P,該質(zhì)粒經(jīng)

5、酶切、PCR、測序鑒定均表明成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/N P。構(gòu)建的質(zhì)粒含一個(gè)核苷酸長度為1432bp的基因,和A/PR/8/34(H1N1)(GenBank/NCB,GI:8486129)有98％的同源性。
　　 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后用甲型流感病毒檢測試劑盒檢測到24h、48h、72h細(xì)胞內(nèi)外NP的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)核蛋白基因的真核表