大豆種子貯藏蛋白亞基特異種質(zhì)的篩選、鑒定及其遺傳穩(wěn)定性與功能性研究.pdf

1、本研究以1400份大豆品種為材料，在篩選到蛋白亞基特異種質(zhì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了亞基含量年份問穩(wěn)定性分析、亞基缺失類型的進(jìn)一步鑒定和遺傳分析以及種質(zhì)創(chuàng)新、亞基特異種質(zhì)的蛋白功能性評(píng)價(jià)等方面的研究。以期為進(jìn)一步發(fā)掘我國(guó)豐富的大豆基因資源、篩選出亞基組成優(yōu)良的大豆材料，明確亞基變異類型遺傳規(guī)律，闡明亞基變異對(duì)大豆蛋白功能性的影響奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下： 1、1400份參試品種的11S／7S比值范圍為0.44～3.64，平均值為1.68±0

2、.37，鑒定出34份亞基含量特異材料，其中包括α′和α亞基含量低、β亞基含量低、A<,3>B<,4>亞基缺失、A<,5>A,,4>B<,3>亞基缺失和A<,1a>B<,1b>亞基缺失種質(zhì)。理化誘變結(jié)果表明：化學(xué)誘變率為2.92％，物理誘變率為5.71％，對(duì)大豆蛋白的誘變效果0.4％EMS處理優(yōu)于0.2％EMS處理，而<'60>Co γ射線慢照射處理優(yōu)于化學(xué)誘變處理。并從M<,3>代種子中篩選出了211粒亞基變異種質(zhì)。 2、分析了

3、2003年、2004年和2005年種植的280份大豆種質(zhì)的7s和11S組分及其亞基含量間的差異，結(jié)果表明：品種對(duì)大豆貯藏蛋白7S、11S組分及其亞基含量、7S+11S和11S／7S值的影響均達(dá)極顯著水平，年份除對(duì)α亞基和A<,4>亞基含量的影響達(dá)極顯著水平外，對(duì)其它亞基含量及7S、11S、7S+11S和11S／7S值的影響均不顯著；品種×年份對(duì)7S、11S、11S／7S值、α亞基、A<,4>亞基和A<,5>亞基含量的影響達(dá)極顯著水平，對(duì)

4、其它組分和亞基含量的影響均不顯著。 3、在SDS-PAGE篩選到蛋白亞基特異種質(zhì)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2-DE)分析大豆貯藏亞基正常品種南農(nóng)大黃豆和亞基變異品種桂陽(yáng)紫金豆種子總蛋白的蛋白質(zhì)組。差異蛋白質(zhì)組學(xué)顯示，等電點(diǎn)和分子量分別約為5.40和37.85 kDa、5.24和37.2 kDa、5.15和37.05 kDa的蛋白質(zhì)點(diǎn)在正常品種種子中表達(dá)而在缺失品種中未表達(dá)。對(duì)這3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)

5、間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測(cè)定其膠內(nèi)酶解后的肽質(zhì)量指紋譜(PMF)，對(duì)獲得的PMF用Mascot軟件在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢比對(duì)，鑒定出這3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)均為大豆球蛋白A<,1a>B<,1b>亞基同源三聚體，表明桂陽(yáng)紫金豆種子貯藏蛋白缺少A<,1a>b<,1b>亞基。 4、研究了4個(gè)不同蛋白亞基類型(A<,1a>B<,1b>亞基正常、A<,1a>B<,1b>亞基缺失； A<,3>B<,4>亞基正常、A<,3>B<,4>亞基缺

6、失)的品種所配成的6個(gè)雜交組合的F<,1>、F<,2>、F<,3>種子亞基表現(xiàn)及其遺傳。結(jié)果表明：A<,1a>B<,1b>亞基、A<,3>B<,4>亞基正常分別受一對(duì)顯性基因控制，A<,1a>B<,1b>亞基、A<,3>B<,4>亞基缺失分別受一對(duì)隱性基因控制，控制A<,1a>B<,1b>亞基、A<,3>B<,4>亞基正常的基因分別對(duì)控制A<,1a>B<,1b>亞基、A<,3>B<,4>亞基缺失的基因均表現(xiàn)為完全顯性，其F<,2>的分離

7、均符合3：1的遺傳比例。同時(shí)，利用聚合雜交方法，在缺失A<,1a>B<,1b>亞基、A<,23>B<,4>亞基和A<,5>A<,4>B<,3>亞基單株間及其分離后代間進(jìn)行雜交，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)表明：獲得了5份缺失A<,1a>B<,1b>亞基、A<,3>B<,4>亞基和A<,5>A<,4>B<,3>亞基的創(chuàng)新種質(zhì)。5、為明確提取分離大豆貯藏蛋白11S和7S兩種主要組分的最適方法，采用凱氏定氮和SDS-PAGE分析，從浸提液種類、提取

8、液pH值、浸提次數(shù)和溫度、料液比、Tris-HC1濃度和還原劑種類等影響提取分離效果的因素著手，綜合Nagano法和Thanh法兩者的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)提取分離方法進(jìn)行了進(jìn)一步的改進(jìn)。結(jié)果表明：浸提液采用pH8.5、含0.01m01／L亞硫酸氫鈉的0.03～0.06m01／L Tris-HCl緩沖液系統(tǒng)，提取溫度45℃，料液比1:15，重復(fù)浸提兩次；分離過程中，在pH6.4沉淀離心分離出11S組分、調(diào)pH5.5沉淀離心分離出中間產(chǎn)物后，再調(diào)pH值

9、至4.8沉淀離心分離出7S組分。優(yōu)化后的方法顯著提高了11S和7S組分的得率、蛋白含量和純度。 6、以5個(gè)具遺傳穩(wěn)定性的蛋白亞基變異類型大豆品種(系)制備的分離蛋白和南農(nóng)大黃豆粗7S蛋白為材料，對(duì)其溶解性、凝膠質(zhì)構(gòu)特性、乳化性和乳化穩(wěn)定性以及DSC特性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明：在溶解性方面，11S組分單個(gè)亞基缺失對(duì)大豆蛋白的溶解性沒有顯著影響。在凝膠質(zhì)構(gòu)特性方面，A<,3>B<,4>亞基缺失、11S組分含量顯著降低對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)特性影響

10、顯著；7S組分含量與凝膠彈性呈顯著正相關(guān)；11S組分含量與凝膠硬度、膠粘性和破裂強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)，與凝膠內(nèi)聚性呈極顯著正相關(guān)，與凝膠彈性呈極顯著負(fù)相關(guān)；11S／7S值與凝膠硬度、內(nèi)聚性和膠粘性均呈顯著正相關(guān)，與凝膠彈性呈極顯著負(fù)相關(guān)。在乳化性和乳化穩(wěn)定性方面，11S組分單個(gè)亞基缺失對(duì)乳化性和乳化穩(wěn)定性影響不顯著，11S組分含量顯著降低或缺失對(duì)乳化性和乳化穩(wěn)定性影響顯著。在熱穩(wěn)定性方面，粗7S蛋白和M11SR所制分離蛋白變性溫度和變性焓較