人細(xì)胞色素P450氧化還原酶基因多態(tài)性對CYP3A4和CYP2B6代謝活性的影響.pdf

1、人NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶(EC1.6.2.4;NADPH-cvtochromeP450Oxidoreductase;POR)是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上一個重要的黃素蛋白,它是唯一的傳遞電子給人細(xì)胞素P450(CytochromeP450,CYP)酶系并幫助其完成對底物氧化功能的輔酶。POR整體敲除對小鼠具有早期胚胎致死性,而POR肝部定點敲除的小鼠在形態(tài)和生殖上都是正常的,但其藥物代謝的能力大大下降。POR能夠還原一系列內(nèi)/外源

2、性的電子受體,包括:細(xì)胞色素C,鐵氰化鉀和2,6一二氯靛酚。它還能夠直接代謝活化一些重要的藥物,如絲裂霉素C,環(huán)磷酰胺和苯三嗪SR4233,以及環(huán)境毒物,如百草枯。編碼XPOR的基因具有較強的基因多態(tài)性。自2004年六個POR的錯義突變體(Y181D、A287P、R457H、V492E、C569Y和V608F)首次被報道以來,到目前為止已有超過40個不同的POR錯義突變體被報道。這些報道對于POR的錯義突變體的功能研究主要集中于其對一系

3、列激素代謝紊亂相關(guān)疾病的發(fā)生的影響上,然而關(guān)于其在藥物代謝中的作用卻鮮有涉及。
　　 重組藥物代謝酶是藥物體外代謝研究的一項重要工具,可以為體內(nèi)代謝得到的結(jié)果提供一些解釋和依據(jù)或者用來預(yù)測體內(nèi)代謝的情況。通過體外重組表達(dá)某個酶的多種突變體,并對它們催化代謝某種藥物的能力進(jìn)行評價比較,所得結(jié)果可以為藥物基因組學(xué)研究提供一定的參考信息。本實驗采Bac-to-BacTM桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得了活性較好的POR野生型及已報道的6種

4、POR錯義突變型蛋白(K49N、A115V、Y181D、S244C、A287P、G413S),首先,考察了POR錯義突變體在直接還原底物細(xì)胞色素C時產(chǎn)生的活性差異;繼而進(jìn)一步系統(tǒng)地考察了這6種POR錯義突變體在參與CYP3A4和CYP286介導(dǎo)的代謝反應(yīng)中所產(chǎn)生的影響,具體三部分的實驗如下所述:
　　 1野生型POR及其突變株的構(gòu)建及表達(dá)
　　 目前幾乎在所有報道的關(guān)于POR突變體活性影響的研究中使用的都是原核表達(dá)系統(tǒng),

5、得到的通常都是氨基端缺少了一段含有27個氨基酸的疏水性序列的重組POR蛋白,在本實驗中,我們采用Bac-to-BacTM桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得了含有全長序列的POR野生型及突變型蛋白。
　　 本實驗以含有POR野生型基因pFastBacTM1重組質(zhì)粒為模板,通過PCR在基因的兩側(cè)加入BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點,同時在POR野生型基因終止密碼子前加入6個組氨酸密碼子,以便用his-tag抗體進(jìn)行westernblot鑒定

6、,然后通過定點突變技術(shù)獲得POR突變體的DNA序列。經(jīng)測序驗證后,選取序列正確的PORs與pFastBacTM1質(zhì)粒連接,構(gòu)建pFastBacTM1-PDRs重組質(zhì)粒。重組pFastBacTM1-PORs轉(zhuǎn)化MAXEfficiencyDH10BacTMcompetentEscherichiacoli后,在DH10Bac發(fā)生轉(zhuǎn)座,獲得Bacmid-PORs重組粘粒。用此重組粘粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,即可獲得第一代重組桿狀病毒。通過將病毒反復(fù)感染

7、細(xì)胞以獲得較高滴度的P3代病毒后,用real-timePCR對病毒滴度進(jìn)行定量并優(yōu)化好表達(dá)條件后,即可獲得活性較好的重組POR野生型和各突變型蛋白。實驗過程中還平行構(gòu)建和表達(dá)了野生型的CYP3A4和CYP286蛋白,并通過CO差示光譜的方法對其含量進(jìn)行了測定。隨后以細(xì)胞色素C為底物,在NADPH系統(tǒng)中對POR野生型以及其突變體進(jìn)行活性測定,實驗結(jié)果顯示,POR突變體A115V、Y181D、A287P對細(xì)胞色素C的還原活性有顯著下降,活性

8、分別為野生型的69％、13%和21%;而突變體G413S對細(xì)胞色素C的還原活性則明顯高出野生型約77%;POR突變體(K49N和S244C)的活性則與野生型相近分別為野生型的85%和113%。該部分實驗初步證明:POR的基因多態(tài)性在一定程度上對其直接代謝某些化合物是有所影響,并且不同的錯義突變體影響的程度可能不同。2POR基因多態(tài)性對CYP3A4代謝活性的影響本部分實驗選擇了CYP450中含量最高的CYP3A4亞家族作為模型和參考對象,

9、進(jìn)一步通過Bac-to-BacTM系統(tǒng)共表達(dá)了CYP3A4和POR野生型及其突變體,繼而選用CYP3A4活性鑒定的探針底物睪酮,在體外對CYP3A4-PORs的代謝活性差異進(jìn)行了評價,以檢測POR的基因多態(tài)性對CYP3A4代謝活性的影響。本章實驗中,Y181D和A287P這兩個POR的突變體被發(fā)現(xiàn)幾乎完全抑制了CYP3A4對底物睪酮的代謝能力,在20μmol/L-400μmol/L的底物濃度范圍內(nèi),無任何代謝產(chǎn)物生成,這與上一章在細(xì)胞色

10、素C活性測試中所的到的結(jié)果相一致;其次,CYP3A4-K49N和CYP3A4-A115V的Km值和Vmax值與CYP3A4-WT的Km值和Vmax值相比,均具有顯著性差異,因而其Clint(Vmax/Km)也明顯比CYP3A4-WT高出～35%;突變體G413S在細(xì)胞色素C還原活性測試中表現(xiàn)出高于野生型約77%的還原活性,與此一致的是,G413S在對CYP3A4介導(dǎo)的代謝活性研究中,也表現(xiàn)出較高的代謝活性,就綜合代謝能力Clint來看,

11、其活性明顯高出CYP3A4-WT大約65%。該部分實驗結(jié)果進(jìn)一步提示,POR的基因多態(tài)性在一定程度上是會影響CYP450的代謝活性,POR代謝功能的紊亂,必將會對CYP450的藥物代謝能力造成嚴(yán)重的影響,并且不同的錯義突變體影響的程度可能不同,而這些不同僅從POR突變體對其直接底物代謝的影響程度是無法準(zhǔn)確地預(yù)測其在其他類型底物及CYP酶介導(dǎo)的代謝過程中的作用情況。
　　 3POR基因多態(tài)性對CYP286代謝活性的影響
　　

12、 本部分實驗選擇了CYP450中含量較低但是卻擔(dān)當(dāng)了人體內(nèi)許多重要藥物代謝功能的CVP286為另一個考察對象,進(jìn)一步通過Bac-to-BacTM系統(tǒng)共表達(dá)了CYP286和POR野生型以及突變體,然后選用CYP286活性鑒定的探針底物安非他酮,通過體外實驗對CYP286-PORs的代謝活性差異進(jìn)行了評價,以檢測POR的基因多態(tài)性對CYP286代謝活性的影響。在上一章中,Y181D和A287P這兩個突變體幾乎完全抑制了CYP3A4對底物睪

13、酮的代謝能力,而本章實驗結(jié)果顯示,CYP286-Y181D和CYP286-287P這兩個突變體與CYP286-WT相比,雖然其Km具有顯著性的差異,但是由于其Vmax也發(fā)生了同等幅度的變化,因而通過Clint綜合來看,其活性變化降低為野生型的70%。同時,在上一章中,CYP3A4-K49N對睪酮的代謝活性比CYP3A4-WT明顯高出31%;然而,在本章中,CYP286-K49N對安非他酮的代謝活性僅為野生型的74%,具有顯著性差異。最后

14、,A115V和G413S在支持CYP3A4對睪酮的代謝時,其代謝活性分別高出野生型36%和65%。而在CYP286代謝活性測試實驗中,CYP286-A115V和CYP286-G413S對安非他酮的代謝活性與野生型類似。結(jié)合上一部分,本實驗的結(jié)果提示,POR的錯義突變體對不同的CYP酶介導(dǎo)的底物代謝活化的影響可能有所不同,且很難僅從POR突變體支持一種CYP酶介導(dǎo)的某一個底物的催化反應(yīng)中的情況來推測其對其他所有的CYP酶及底物的支持能力。

15、在將來的研究當(dāng)中可以進(jìn)一步利用本實驗中建立的方法對更多的CYP酶及底物進(jìn)行研究,也可用同樣的體系對CYP酶系的基因多態(tài)性功能進(jìn)行研究。
　　 本課題得到的實驗結(jié)果提示POR的基因多態(tài)性在個體中,對CYP3A4和CYP286的藥物代謝能力的影響是具有顯著性差異的,我們既不能僅從POR突變體對其直接底物代謝的影響程度,來準(zhǔn)確預(yù)測其在其他類型底物及CYP酶介導(dǎo)的代謝過程中的作用情況,也不能僅從POR突變體支持一種CYP酶介導(dǎo)的某一個底