30127.人細(xì)胞色素p450氧化還原酶基因多態(tài)性對(duì)抗癌藥物及環(huán)境毒物活化的影響研究

1、浙江大學(xué)藥學(xué)院博士學(xué)位論文人細(xì)胞色素P450氧化還原酶基因多態(tài)性對(duì)抗癌藥物及環(huán)境毒物活化的影響研究姓名：李丹曦申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：藥物分析學(xué)指導(dǎo)教師：洪鈞言陳樞青20090901浙江人學(xué)博：學(xué)位論文中文摘要涉及。本課題系統(tǒng)地考察了已報(bào)道ff可POR錯(cuò)義突變體在POR參與的抗癌藥物及環(huán)境毒物代謝活化中的影響。首先，利用FlpInTMCHO細(xì)胞系統(tǒng)重組表達(dá)了PoR野生型及28個(gè)錯(cuò)義突變體，考察了POR錯(cuò)義突變體對(duì)代謝直接底物絲裂霉素C產(chǎn)

2、生細(xì)胞毒性的影響；繼而進(jìn)一步建立了能同時(shí)表達(dá)CYP酶系和POR的雙表達(dá)細(xì)胞系，以考察POR的突變體對(duì)CYP286介導(dǎo)的環(huán)磷酰胺代謝活化及CYP2A13介導(dǎo)的黃曲霉毒素代謝活化的影響。具體三部分的實(shí)驗(yàn)如下所述：1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染POR突變體的細(xì)胞系構(gòu)建及其對(duì)絲裂霉素c的敏感性研究該部分實(shí)驗(yàn)應(yīng)用FlpIn刑CHO系統(tǒng)成功地構(gòu)建了含POR的28種錯(cuò)義突變體cDNA的表達(dá)載體，并完成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染得到經(jīng)Westernblot鑒定能穩(wěn)定表達(dá)POR野生型及各突變

3、體的FlpInTMCHO細(xì)胞系。之后以該細(xì)胞系完成了POR突變體對(duì)絲裂霉素C這一重要抗癌前體藥物經(jīng)POR代謝活化引起的細(xì)胞毒性的影響的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表達(dá)突變體R316W，H628P和V6311的細(xì)胞對(duì)絲裂霉素C的耐受性顯著提高。而對(duì)于突變體Y459H和L565P，表達(dá)它們的細(xì)胞其對(duì)絲裂霉素C的敏感程度幾乎和表達(dá)空載體的空白細(xì)胞一致。本實(shí)驗(yàn)中得到的該細(xì)胞系還可進(jìn)一步應(yīng)用于研究POR介導(dǎo)的其他化合物的代謝活化。2利用雙表達(dá)系統(tǒng)考察PO

4、R突變體對(duì)于CYP286介導(dǎo)的環(huán)磷酰胺細(xì)胞毒性的影響該部分實(shí)驗(yàn)中使用了FlpIIl刑cHo細(xì)胞系統(tǒng)先隨機(jī)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)了人CYP286，而后利用通過活性篩選確定ff寸CYP286表達(dá)量較高的單克隆細(xì)胞進(jìn)行二次轉(zhuǎn)染，使得POR野生型及突變體cDNA定點(diǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后插入細(xì)胞基因組的FlpIn刑位點(diǎn)，從而保證了CYP286和POR野生型及各突變體在不同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的表達(dá)量的一致性。再進(jìn)一步比較選定POR各突變體對(duì)CYP介導(dǎo)的環(huán)磷酰胺代謝的影響。