人CYP2B6的體外表達(dá)及活性鑒定.pdf

1、細(xì)胞色素P450同工酶屬于血紅蛋白超家族,是參與催化眾多外源物和內(nèi)源物生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的重要酶系,主要存在于肝臟中。細(xì)胞色素P450酶系催化致癌物、環(huán)境污染物以及藥物的代謝,使這些化合物親水性或極性增加,促進(jìn)排泄,防止毒性物質(zhì)在體內(nèi)累積。其中CYP1、2、3族負(fù)責(zé)大多數(shù)外源物的代謝,具有廣泛的底物特異性。細(xì)胞色素P4502B6,簡(jiǎn)稱(chēng)CYP2B6,是研究相對(duì)較少的同工酶,主要原因是一方面該酶在人肝中的mRNA水平和蛋白質(zhì)含量比較低,另一方面是

2、缺乏合適的探針工具。隨著高靈敏度和選擇性的免疫檢測(cè)方法的應(yīng)用,人們?cè)谌烁沃袡z測(cè)到CYP2B6較高的表達(dá)水平。近年來(lái)CYP2B6引起了更多的關(guān)注,越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明CYP2B6參與催化許多重要臨床藥物的代謝。其中安非他酮是CYP2B6的特異性藥物,可作為酶活性測(cè)定的探針底物。體外表達(dá)CYP2B6重組酶對(duì)研究該酶在藥物代謝中的作用具有重要意義。近年來(lái)?xiàng)U狀病毒介導(dǎo)的昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)得到了廣泛地應(yīng)用,本課題通過(guò)該系統(tǒng)表達(dá)CYP2B6重組酶,并進(jìn)行活

3、性鑒定。
　　1.CYP2B6基因的克隆根據(jù)基因庫(kù)CYP2B6的cDNA序列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到CYP2B6的cDNA基因片段,cDNA片段與pGEM-T載體連接,重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序。通過(guò)定點(diǎn)突變方法獲得野生型基因序列,經(jīng)測(cè)序的CYP2B6基因片段亞克隆到穿梭載體pFastBac載體上,該載體能夠與Bacmid發(fā)生特定位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座重組。連接后的重組質(zhì)粒CYP2B6-pFastBac轉(zhuǎn)化到含有Bacmid的大腸桿菌D

4、H10Bac感受態(tài)細(xì)胞中,通過(guò)藍(lán)白篩選獲得含有CYP2B6基因片段的重組粘粒,該重組粘粒通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞,從而獲得重組桿狀病毒。
　　2.CYP2B6同工酶與CYPOR的共表達(dá) 將高滴度的CYP2B6病毒液和CYPOR病毒液共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，表達(dá)體系中的血紅素濃度為3μg/mL。表達(dá)三至四天后，收獲細(xì)胞，細(xì)胞沉淀用PBS緩沖液洗滌后進(jìn)行超聲破碎，即得到含有CYP2B6重組酶的細(xì)胞破碎液。3.表達(dá)產(chǎn)物分析細(xì)胞破碎液進(jìn)行SDS

5、-聚丙烯酞胺凝膠電泳，將分離膠電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用鼠His抗體和二抗分別先后室溫孵育1h，用PBS洗過(guò)后，用DAB法進(jìn)行顯色。通過(guò)Western Blot法檢測(cè)到帶有his標(biāo)簽的目的蛋白的表達(dá)。細(xì)胞破碎液進(jìn)行超速離心后用CO-差示光譜法進(jìn)行P450含量測(cè)定，沒(méi)有檢測(cè)到450nm處的吸收峰。4.活性鑒定采用CYP2B6的特異性底物安非他酮進(jìn)行重組酶活性測(cè)定，在再生系統(tǒng)溶液中加入CYP2B6重組酶、系列濃度的底物進(jìn)行孵育。按Linewe