中國野生葡萄新基因轉化歐洲葡萄品種的研究.pdf

1、無核葡萄是當今世界葡萄消費和育種的重要方向之一，但生產上主要栽培的歐洲葡萄無核品種抗病性差，中國野生葡萄是抗葡萄真菌病害的重要基因資源。通過向歐洲葡萄無核品種轉移抗病基因是培育抗病無核品種的有效途徑。利用課題組通過mRNA差顯技術從中國野生葡萄高抗白粉病的華東葡萄白河-35-1中克隆的與抗白粉病相關的基因乙二醛氧化酶新基因cDNA全長序列，通過構建表達載體pWR306-GLOXrg，采用農桿菌介導法對歐洲無核葡萄品種無核白、底來特和愛莫

2、無核及煙草，進行了轉基因研究。 取得的主要結果： 1.無核葡萄試管苗的建立 對經4℃低溫沙藏的葡萄硬枝，冬季以10％的石灰氮涂芽處理，促進萌芽，用新梢建立葡萄無菌系。對葡萄新梢剪取單芽莖斷進行擴繁。適宜的繼代培養(yǎng)基為NN69+0.1mg/LIBA,生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg/LNAA。 2.葡萄器官再生途徑的建立 以無核葡萄葉片、葉柄及莖斷為外植體，進行再生研究。篩選獲得的適宜培養(yǎng)基分別是

3、，葉片再生：MS+2.0mg/LTDZ+0.1mg/LNAA+500mg/LCH+5g/LPVP；葉柄和莖斷再生：NN69+4.0mg/LTDZ+0.1mg/LNAA+500mg/LCH+5g/LPVP。 3.葡萄胚狀體途徑方式的再生 以愛莫無核自交的胚珠為試材，剝胚進行胚狀體誘導。幼胚在培養(yǎng)基(WP(固)+0.225mg/L6-BA+60g/L蔗糖+2g/L活性炭+500mg/L水解酪蛋白)上胚性愈傷和胚狀體的誘導率為

4、75％；在培養(yǎng)基(WP(固)+1.0mg/LTDZ+60g/L蔗糖+2g/L活性炭+500mg/L水解酪蛋白)上胚性愈傷和胚狀體增殖良好。 4.中國野生葡萄屬乙二醛氧化酶植物表達載體的構建 雙酶切重組質粒pGEM-T-GLOXrg與中間表達載體pWR306,將GLOXrg基因片段與線性表達載體pWR306進行定向連接，構建了芪合成酶基因的植物表達載體。通過酶切、電泳鑒定，證明GLOXrg基因已成功構建到植物表達質粒pWR

5、306中，將此克隆命名為pWR306-GLOXrg。 5.葡萄遺傳轉化體系的建立及轉基因葡萄植株的獲得 通過對無核白、底來特和愛莫無核的葉片，以及愛莫無核胚珠誘導的胚性愈傷組織和胚狀體以農桿菌介導的葡萄遺傳轉化的影響因子的探討，確定了轉化方法和步驟為：農桿菌濃度OD600值為0.2～0.4，侵染葡萄材料8～10min,共培養(yǎng)2天后采用500mg/L的頭孢青霉素進行抑菌處理，以潮霉素濃度梯度進行轉化后的篩選。 最初

6、獲得124株潮霉素抗性植株，其中16株為無核白葉片轉化后獲得，愛莫無核胚性愈傷及胚狀體轉化后獲得108株潮霉素抗性植株。再生的抗性葡萄植株經熒光蛋白及PCR檢測，其中9株檢測呈現陽性，均為經愛莫無核胚狀體再生而來。初步證明中國野生葡萄屬乙二醛氧化酶已被轉化到歐洲葡萄愛莫無核中。 6.煙草的遺傳轉化及檢測 將植物表達載體導入農桿菌后首先侵染煙草葉片，潮霉素篩選獲得抗性植株經熒光蛋白檢測和PCR檢測獲得了56株陽性植株，并已