TLR誘導(dǎo)NF-κB活化上調(diào)NLRP3表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　 NLRP3(NOD-LRRScontainingpyrindomain3)是NLR(NOD-likereceptor)家族成員之一，NLRP3炎癥小體在caspase-1的活化和IL-1β的成熟分泌過程中起重要的作用。目前NLRP3的研究多側(cè)重于炎癥小體的活化機(jī)制，而NLRP3表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本課題研究目的在于闡明NLRP3表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。
　　 本課題研究發(fā)現(xiàn)在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR配體能夠上調(diào)NL

2、RP3mRNA和蛋白的表達(dá)，并且這一上調(diào)作用依賴于NF-κB的活化。通過構(gòu)建一系列NLRP3啟動(dòng)子區(qū)不同長度的截短突變體熒光報(bào)告基因載體，并對(duì)其熒光報(bào)告基因活性分析，我們?cè)贜LRP3啟動(dòng)子區(qū)找到兩個(gè)NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)(nt-1303to-1292和nt-1238to-1228)，并且用ChIP和EMSA的方法進(jìn)一步驗(yàn)證NF-κB和NLRP3啟動(dòng)子的直接結(jié)合作用。本課題闡明了NF-κB和NLRP3啟動(dòng)子區(qū)nt-1303to-1292和n

3、t-1238to-1228這兩個(gè)位點(diǎn)特異性結(jié)合，從而上調(diào)NLRP3的表達(dá)的分子機(jī)制。方法
　　 1.檢測(cè)TLR配體誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3表達(dá)情況
　　 1.1LPS/PGN刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，RT-PCR和Westernblot檢測(cè)NLRP3mRNA和蛋白的表達(dá)
　　 1.2LPS/PGN刺激RAW264.7細(xì)胞系，RT-PCR和Westernblot檢測(cè)NLRP3mRNA和蛋白的表達(dá)
　　

4、 2.檢測(cè)NF-κB抑制劑(JSH-23)預(yù)處理小鼠巨噬細(xì)胞，TLR配體誘導(dǎo)的NLRP3
　　 表達(dá)情況
　　 2.1NF-κB特異性抑制劑(JSH-23)預(yù)處理小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞，RT-PCR和Westernblot檢測(cè)LPS/PGN誘導(dǎo)的NLRP3mRNA和蛋白的表達(dá)
　　 2.2NF-κB特異性抑制劑(JSH-23)預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞系，RT-PCR和Westernblot檢測(cè)LPS/PGN誘導(dǎo)的

5、NLRP3mRNA和蛋白的表達(dá)
　　 3.雙熒光報(bào)告基因分析LPS誘導(dǎo)的NLRP3啟動(dòng)子活化情況
　　 3.1一系列小鼠NLRP3基因啟動(dòng)子的克隆以及相應(yīng)報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建利用TRANSFAC6.0數(shù)據(jù)庫對(duì)NCBI基因數(shù)據(jù)庫中小鼠NLRP3基因(NT-096135)5'上游3500bp序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)合適的上下游引物，以RAW264.7細(xì)胞系基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增一系列NLRP3啟動(dòng)子區(qū)DNA片段(nt-3

6、033to+166,-2032to+166,-1733to+166,-1434to+166,-1113to+166，-824to+166)，引入限制性酶切位點(diǎn)KpnI、XhoI，將PCR產(chǎn)物雙酶切克隆入報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-basic，構(gòu)建6個(gè)重組報(bào)告基因質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證。
　　 結(jié)合基因組數(shù)據(jù)庫中信息及前期結(jié)果，選取小鼠NLRP3啟動(dòng)子nt-2032to-1434和nt-1434to-1113兩個(gè)片段，設(shè)計(jì)合適引物

7、構(gòu)建報(bào)告基因質(zhì)粒，構(gòu)建方法同上，菌液PCR驗(yàn)證重組載體是否構(gòu)建成功。
　　 3.2報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞系及雙熒光素酶活性分析
　　 將構(gòu)建的8個(gè)重組報(bào)告基因質(zhì)粒和不含啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的陰性對(duì)照pGL3-basic分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞系，24h后加LPS或者PGN刺激8h，然后裂解細(xì)胞并收集裂解液，用Promega雙熒光報(bào)告基因分析儀對(duì)其進(jìn)行雙熒光素酶活性分析，每組實(shí)驗(yàn)至

8、少重復(fù)三次，每次設(shè)置3-4個(gè)復(fù)孔。
　　 3.3報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系及雙熒光素酶活性分析
　　 將構(gòu)建的8個(gè)重組報(bào)告基因質(zhì)粒和不含啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的陰性對(duì)照pGL3-basic分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK以及pCMV-N-MyD88質(zhì)?；蛘遬CMV-N-vector同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系，24h后裂解細(xì)胞并收集裂解液，用Promega雙熒光報(bào)告基因分析儀對(duì)其進(jìn)行雙熒光素酶活性分析，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，

9、每次設(shè)置3-4個(gè)復(fù)孔。
　　 4NLRP3啟動(dòng)子區(qū)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別
　　 4.1構(gòu)建NLRP3啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變報(bào)告基因質(zhì)粒
　　 根據(jù)前期結(jié)果以及TRANSFAC6.0數(shù)據(jù)庫分析，在nt-1434to-1113區(qū)間內(nèi)預(yù)測(cè)到nt-1303to-1292(A)(AGGGAACCCCCG)和nt-1238to-1228(B)(GGAAAATCCAT)兩個(gè)可能的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，利用定點(diǎn)突

10、變?cè)噭┖?TOYOBOKOD-Plus-MutagenesisKit)，以NLRP3(-1434/-1113)報(bào)告基因質(zhì)粒為模板對(duì)A、B兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)單突變和雙突變，構(gòu)建NLRP3(-1434/-1113)MutA、NLRP3(-1434/-1113)MutB、NLRP3(-1434/-1113)MutAB三個(gè)重組報(bào)告基因質(zhì)粒，構(gòu)建和驗(yàn)證方法同3.2。
　　 4.2突變體報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞系及雙熒光報(bào)告基因分

11、析轉(zhuǎn)染和雙熒光報(bào)告基因分析方法同3.2
　　 4.2突變體報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系及雙熒光報(bào)告基因分析轉(zhuǎn)染和雙熒光報(bào)告基因分析方法同3.3。
　　 5體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)分析NF-κB與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合情況
　　 5.1凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)體外分析NF-κB亞基p65與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合情況
　　 合成NLRP3啟動(dòng)子區(qū)nt-1313to-1284段寡核苷酸序列（包含預(yù)測(cè)NF-κB結(jié)合

12、位點(diǎn)A），生物素標(biāo)記，之后進(jìn)行EMSA分析。
　　 5.2染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)體內(nèi)分析NF-κB亞基p65與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合情況
　　 LPS刺激原代腹腔巨噬細(xì)胞1h，用CHIP試劑盒(UpstateBiotechnology，NY)對(duì)巨噬細(xì)胞染色質(zhì)進(jìn)行固定、沉淀、純化，設(shè)計(jì)包含NLRP3nt-1348to-1183片段的引物，以純化的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
　　

13、 結(jié)果
　　 1TLR配體上調(diào)小鼠巨噬細(xì)胞中NLRP3表達(dá)
　　 無論是在mRNA還是蛋白水平，無論是在小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中還是在RAW264.7細(xì)胞系中，LPS/PGN均能刺激NLRP3的表達(dá)上調(diào)，且呈一定的時(shí)間依賴性。
　　 2TLR誘導(dǎo)的NLRP3表達(dá)依賴于NF-κB活化
　　 2.1小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中，在mRNA和蛋白水平上，分別檢測(cè)到JSH-23預(yù)處理組LPS/PGN誘導(dǎo)的NLRP3表達(dá)水

14、平明顯比DMSO對(duì)照組低。2.2RAW264.7細(xì)胞系中得到與2.1相似的結(jié)果，而且JSH-23預(yù)處理組LPS/PGN誘導(dǎo)的NLRP3表達(dá)消失。
　　 以上兩個(gè)結(jié)果說明LPS/PGN等TLR配體誘導(dǎo)的NLRP3表達(dá)與NF-κB活化有關(guān)，當(dāng)NF-κB通路被阻斷之后TLR配體誘導(dǎo)的NLRP3表達(dá)被減弱甚至被阻斷。
　　 3雙熒光報(bào)告基因分析明確NF-κB與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合靶位點(diǎn)
　　 3.1小鼠NLRP3啟動(dòng)

15、子區(qū)一系列截短突變體報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建及測(cè)序驗(yàn)證
　　 成功構(gòu)建小鼠NLRP3啟動(dòng)子區(qū)一系列截短突變體報(bào)告基因質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證插入的片段序列和方向正確無誤，分別命名為NLRP3(-3033)、NLRP3(-2032)、NLRP3(-1733)、NLRP3(-1434)、NLRP3(-1113)、NLRP3(-834)、NLRP3(-2032/-1434)、NLRP3(-1434/-1113)。
　　 3.2報(bào)告基

16、因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞系及雙熒光素酶活性分析
　　 將上述質(zhì)粒分別與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)RAW264.7細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染24h后LPS或者PGN刺激8h，收集細(xì)胞裂解液做雙熒光素酶報(bào)告基因活性分析。報(bào)告基因活性分析顯示:LPS刺激組的NLRP3(-3033)雙熒光素酶活性約是不刺激組的4倍，這說明在NLRP3啟動(dòng)子區(qū)nt-3033to+166之間包含LPS上調(diào)NLRP3表達(dá)的順式作用元件。其他截短突變體雙熒光報(bào)告基因分

17、析結(jié)果顯示，NLRP3(-2032)、NLRP3(-1733)、NLRP3（-1434）報(bào)告基因活性LPS刺激組分別是其對(duì)應(yīng)不刺激組的5倍、4倍、3倍，而NLRP3(-1113)、NLRP3（-834）報(bào)告基因活性在LPS刺激組和不刺激組之間無明顯差異。PGN刺激之后報(bào)告基因活性檢測(cè)得到相似的結(jié)果，這些結(jié)果暗示:LPS/PGN上調(diào)NLRP3表達(dá)的順式作用元件可能位于NLRP3啟動(dòng)子區(qū)nt-1434to-1113之間，即LPS/PGN刺激

18、RAW264.7細(xì)胞，引起的NF-κB入核可能結(jié)合于NLRP3啟動(dòng)子區(qū)nt-1434to-1113之間的某段DNA序列，從而調(diào)控NLRP3的表達(dá)。LPS刺激組的NLRP3(-1434/-1113)報(bào)告基因活性是不刺激組的20倍，LPS刺激之后NLRP3nt-1434to-1113這一區(qū)段的啟動(dòng)子活性明顯增強(qiáng)，而NLRP3(-2032/-1434)與空質(zhì)粒對(duì)照組一樣在刺激組和不刺激組之間，報(bào)告基因活性無顯著差異，這一結(jié)果進(jìn)一步證明了上述結(jié)

19、論。
　　 3.3報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系及雙熒光素酶活性分析
　　 將構(gòu)建的8個(gè)重組報(bào)告基因質(zhì)粒和不含啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的陰性對(duì)照pGL3-basic分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK以及pCMV-N-MyD88質(zhì)?；蛘遬CMV-N-vector同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系，24h后檢測(cè)報(bào)告基因活性，MyD88轉(zhuǎn)染組中NLRP3(-2032)、NLRP3(-1733)、NLRP3(-1434)報(bào)告基因活性分別是其對(duì)照組

20、的2倍、1.5倍、1.5倍，而NLRP3(-1113)、NLRP3(-834)報(bào)告基因活性在MyD88轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組均未活化。這更進(jìn)一步說明了NLRP3啟動(dòng)子的活化依賴NF-κB的活化，而且NF-κB入核可能結(jié)合于NLRP3啟動(dòng)子區(qū)nt-1434to-1113之間的某段DNA序列，從而調(diào)控NLRP3的表達(dá)。
　　 4NLRP3啟動(dòng)子區(qū)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別
　　 4.1成功構(gòu)建了NLRP3(-1434/-1113)Mu

21、tA、NLRP3(-1434/-1113)MutB、NLRP3(-1434/-1113)MutAB三個(gè)定點(diǎn)突變體重組報(bào)告基因質(zhì)粒
　　 4.2定點(diǎn)突變體報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞系及雙熒光素酶報(bào)告基因活性分析
　　 將上述定點(diǎn)突變質(zhì)粒分別與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)RAW264.7細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染24h后LPS刺激8h，收集細(xì)胞裂解液做雙熒光素酶報(bào)告基因活性分析。
　　 報(bào)告基因活性分析顯示:LPS可以明顯

22、的增強(qiáng)NLRP3(-1434/-1113)報(bào)告基因活性，而且當(dāng)兩個(gè)預(yù)測(cè)的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)A、B分別被突變掉之后，LPS仍然能夠增強(qiáng)NLRP3(-1434/-1113)MutA、NLRP3(-1434/-1113)MutB兩個(gè)報(bào)告基因活性，但是當(dāng)兩個(gè)預(yù)測(cè)的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)A、B同時(shí)被突變之后，LPS這一增強(qiáng)作用被減弱，這說明NLRP3啟動(dòng)子區(qū)nt-1434to-1113之間的A、B兩個(gè)位點(diǎn)有可能是LPS刺激引起的NLRP3表達(dá)上調(diào)的順

23、式作用元件所在的位置，且兩個(gè)起協(xié)同作用。
　　 4.3定點(diǎn)突變體報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系及雙熒光素酶報(bào)告基因活性分析
　　 無論是A、B兩位點(diǎn)的單突變體還是雙突變體，突變后MyD88轉(zhuǎn)染組其報(bào)告基因活性未被活化，也就是說A、B兩位點(diǎn)突變之后，NF-κB對(duì)NLRP3啟動(dòng)子的活化作用消失了，這更進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。
　　 5體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NF-κB與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合
　　 5.1EMSA

24、體外驗(yàn)證NF-κB與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合
　　 選取NLRP3啟動(dòng)子區(qū)nt-1313to-1284(A)合成DNA雙鏈并進(jìn)行生物素標(biāo)記以及EMSA分析，分析結(jié)果顯示LPS刺激的腹腔原代巨噬細(xì)胞核蛋白能夠在體外跟探針A結(jié)合，而且加入P65抗體組出現(xiàn)滯后帶，說明是核蛋白中的NF-κB與探針A特異性結(jié)合，這一結(jié)果證實(shí)了NLRP3啟動(dòng)子區(qū)nt-1313to-1284(A)在體外與P65的結(jié)合作用
　　 5.2ChIP體內(nèi)驗(yàn)證N

25、F-κB與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合
　　 以純化之后的DNA片段為模板PCR，LPS未刺激情況下，在anti-actin對(duì)照組和anti-p65實(shí)驗(yàn)組均無目的帶;而在LPS刺激情況下，在anti-p65實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯的特異性的條帶，這一結(jié)果體內(nèi)驗(yàn)證NF-κB與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)nt-1348to-1183片段直接結(jié)合。
　　 結(jié)論
　　 1本課題研究發(fā)現(xiàn)在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR配體能夠上調(diào)NLRP3mRNA和蛋白的表

26、達(dá)，并且這一上調(diào)作用依賴于NF-κB的活化。
　　 2成功構(gòu)建一系列NLRP3啟動(dòng)子區(qū)不同長度的截短突變體及定點(diǎn)突變體熒光報(bào)告基因載體，并對(duì)其熒光報(bào)告基因活性分析，我們?cè)贜LRP3啟動(dòng)子區(qū)找到兩個(gè)NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)（nt-1303to-1292和nt-1238to-1228），這可能是LPS等TLR配體上調(diào)NLRP3表達(dá)的順式作用元件位置。
　　 3ChIP和EMSA的方法進(jìn)一步驗(yàn)證NF-κB和NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的直接

27、結(jié)合作用。本課題闡明了NF-κB與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)nt-1303to-1292(A)和nt-1238to-1228(B)這兩個(gè)位點(diǎn)特異性結(jié)合，從而上調(diào)NLRP3的表達(dá)的這一分子機(jī)制。
　　 創(chuàng)新性和意義
　　 NLRP3炎癥小體作為固有免疫的重要組成部分，在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程中具有重要作用。炎癥小體的研究成為世界范圍內(nèi)的一個(gè)研究熱點(diǎn)，NLRP3作為炎癥小體重要的組成部分，其表達(dá)調(diào)控分子機(jī)制目前尚不清楚。文獻(xiàn)報(bào)道

28、，TLR信號(hào)通路活化能夠誘導(dǎo)人單核細(xì)胞中NLRP3表達(dá)，與此相一致，我們?cè)谛∈缶奘杉?xì)胞中也發(fā)現(xiàn)TLR配體LPS/PGN能夠誘導(dǎo)NLRP3的表達(dá)，因此我們?yōu)檠芯縉LRP3表達(dá)調(diào)控建立了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的體系。
　　 TLR和NLR是兩種最重要的模式識(shí)別受體，最近的研究表明，TLR和NLR兩條信號(hào)通路之間的交互作用對(duì)固有免疫調(diào)節(jié)起到至關(guān)重要的作用。我們的研究證實(shí)了TLR配體可以上調(diào)NLRP3的表達(dá)，這提供了TLR和NLR兩條信號(hào)通路之間

29、存在交互作用的一個(gè)實(shí)例。
　　 本課題運(yùn)用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了一系列NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的報(bào)告基因質(zhì)粒，分析LPS/PGN等對(duì)NLRP3活化的影響，確定了TLR配體激活的NF-κB信號(hào)通路作用于NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的nt-1303to-1292和nt-1238to-1228這兩個(gè)靶位點(diǎn)，并運(yùn)用EMSA和CHIP進(jìn)一步驗(yàn)證。本課題闡明了炎癥相關(guān)因子NLRP3的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，填補(bǔ)了這一研究領(lǐng)域的空白，為炎癥相關(guān)疾病的治療提供了可能的理