AOG抑制LPS誘導(dǎo)的TLR-4-MD-2-NF-κB信號(hào)通路活化的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　 潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，容易癌變。臨床資料分析表明，UC病程8-15年，癌變發(fā)生率達(dá)22％，10-20年達(dá)28％，20年以上則高達(dá)43％。目前，結(jié)直腸癌的預(yù)防措施有:消除不良飲食習(xí)慣，服用化學(xué)預(yù)防藥物，早期診斷及時(shí)治療;其中針對(duì)性的化學(xué)預(yù)防可望在UC癌變中取得突破。UC癌變是一個(gè)漫長(zhǎng)的過程，預(yù)防UC癌變不僅需要明確的藥物作用靶點(diǎn)，而且需要預(yù)防藥物無毒、無

2、副作用。
　　 研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)是UC癌變的中心環(huán)節(jié)，其表達(dá)水平是炎癥癌變的控制器。眾所周知，結(jié)腸腔內(nèi)存在大量共生菌及食物消化殘?jiān)?，?duì)結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞具有潛在的侵襲作用。正常情況下，結(jié)腸粘膜一方面靠本身分泌的粘液加以保護(hù)，另一方面靠其表面存在的各種模式識(shí)別受體通過識(shí)別不同病原生物性物質(zhì)，啟動(dòng)免疫反應(yīng)，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。臨床研究發(fā)現(xiàn)，UC患者腸道菌群發(fā)生改變，G-/G+菌比值顯著增加。
　　 我們的

3、研究發(fā)現(xiàn)，糖聚合度為5的β-(1→4)-半乳寡糖醛酸(AOG)可顯著預(yù)防實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎癌變(93.5％)，動(dòng)物用藥4個(gè)月，未見到任何毒性反應(yīng)。AOG單獨(dú)使用可引起結(jié)腸上皮細(xì)胞膜TLR-4的表達(dá)升高，而與LPS合用卻顯著降低了TLR-4在細(xì)胞膜的表達(dá)。但其結(jié)合位點(diǎn)及分子機(jī)制尚不明確。
　　 而TLR-4與LPS的構(gòu)象研究揭示，TLR-4激動(dòng)劑LPS正是促進(jìn)了MD-2-TLR-4寡聚化，升高細(xì)胞膜TLR-4的表達(dá)水平;而TLR-4的拮

4、抗劑（Eritoran）則抑制MD-2-TLR-4的寡聚化，降低細(xì)胞膜TLR-4的表達(dá)，從而降低NF-κ3的活化水平，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。提示，影響TLR-4在膜的表達(dá)，調(diào)控NF-κB的活性，將是發(fā)掘UC癌變預(yù)防藥物的可行之路。
　　 本課題擬通過構(gòu)建TLR-4、MD-2野生型及突變體慢病毒載體，CD-14慢病毒載體，TLR-4、MD-2基因敲除慢病毒載體;并構(gòu)建TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase信號(hào)通路在H

5、EK293T細(xì)胞中的表達(dá)。觀察AOG、LPS單獨(dú)和聯(lián)合使用對(duì)TLR-4/MD-2/NF-κB信號(hào)通路的影響;觀察TLR-4和MD2敲除后，AOG和LPS處理HT-29細(xì)胞對(duì)TLR-4/MD-2/NF-κB信號(hào)通路的影響;觀察過表達(dá)TLR-4和MD2，對(duì)AOG和LPS誘導(dǎo)的TLR-4/MD-2/NF-κB信號(hào)通路活化的影響;觀察TLR-4和MD-2突變體對(duì)LPS和AOG誘導(dǎo)的TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase信號(hào)通路的

6、影響。從而揭示AOG預(yù)防結(jié)腸炎癌變的分子機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、用ELISA試劑盒測(cè)定上清中TNF-α的釋放量，觀察AOG和LPS對(duì)HT-29細(xì)胞TNF-α釋放水平的影響;
　　 2、用Western Blotting來檢測(cè)HT-29細(xì)胞中NF-κB P65亞基磷酸化水平，從而判斷AOG和LPS對(duì)NF-κB活化程度的影響;
　　 3、用Cell Surface Biotinylation方法在

7、HT-29細(xì)胞中檢測(cè)AOG、LPS單獨(dú)和聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞表面TLR-4表達(dá)水平的影響;
　　 4、以慢病毒為載體，通過shRNA對(duì)TLR-4和MD-2蛋白干擾沉默后，用qRT-PCR檢測(cè)shRNA的干擾效果，進(jìn)而對(duì)TLR-4以及MD-2的shRNA進(jìn)行篩選。
　　 5、以慢病毒為載體，利用篩選出的shRNA對(duì)TLR-4和MD-2干擾沉默后，分別加入LPS及AOG，用ELISA試劑盒測(cè)定上清中的TNF-α的含量，用Weste

8、rnBlotting測(cè)定NF-κ3 P65亞基磷酸化水平。
　　 6、利用慢病毒為載體，通過慢病毒感染，在HT-29細(xì)胞中單獨(dú)或共過表達(dá)TLR-4和MD-2蛋白后，分別加入LPS和AOG，用ELISA試劑盒測(cè)定上清中的TNF-α的含量，用Western Blotting測(cè)定NF-κB P65亞基磷酸化水平7、用TLR-4/MD-2/ NF-κB-luciferase熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)TLR-4突變體、MD-2突變體檢測(cè)LPS和

9、AOG誘導(dǎo)的TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase信號(hào)通路的影響;
　　 8、用TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)MD-2 K122R突變體對(duì)LPS和AOG共同誘導(dǎo)的TLR-4/MD-2/NF-κB-1uciferase信號(hào)通路的影響;
　　 9、用免疫共沉淀法檢測(cè)MD-2 K122R突變體對(duì)TLR-4和MD-2復(fù)合體形成的影響。
　　 結(jié)果：
　　

10、 1、AOG單獨(dú)使用可誘導(dǎo)TNF-α釋放、激活HT-29細(xì)胞的NF-κ3信號(hào)通路;而和LPS聯(lián)合使用則會(huì)抑制抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α的釋放及NF-κB信號(hào)通路，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制LPS引起的NF-κB活化;
　　 2、AOG單獨(dú)使用可促進(jìn)HT-29細(xì)胞的TLR-4蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)，與LPS聯(lián)合應(yīng)用則抑制其引起的TLR-4在膜的表達(dá);
　　 3、AOG激活NF-κB信號(hào)通路依賴TLR-4、MD-2蛋白，敲除TLR-4和MD

11、-2蛋白表達(dá)能抑制AOG對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活;
　　 4、TLR-4突變體TLR-4 R264A對(duì)LPS和AOG激活NF-κB信號(hào)通路都沒有明顯的影響;而突變體K341R和K362R大大降低了LPS和AOG對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活，但相對(duì)于AOG而言其對(duì)LPS的影響較大;
　　 5、MD-2突變體K58R明顯減低了LPS和AOG對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活。突變體S118A對(duì)LPS和AOG激活NF-κB信號(hào)通路的影

12、響不大;而突變體K122R不影響LPS對(duì)信號(hào)通路的激活，而基本完全抑制了AOG的激活作用;
　　 6、通過TLR-4和MD-2突變體對(duì)LPS及AOG誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的影響可以看出，雖然LPS和AOG對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活均依賴于TLR-4和MD-2蛋白，可能均需要形成LPS/TLR-4/MD-2以及AOG/TLR-4/MD-2復(fù)合體，但LPS和AOG與TLR-4、MD-2的結(jié)合位點(diǎn)明顯不同;
　　 7、LPS

13、和AOG單獨(dú)使用均能激活NF-κB信號(hào)通路，而聯(lián)合使用則抑制NF-κB信號(hào)通路。
　　 結(jié)論：
　　 AOG激活NF-κB信號(hào)通路依賴TLR-4、MD-2蛋白，敲除TLR-4和MD-2蛋白表達(dá)能抑制AOG對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活，推測(cè)AOG激活NF-κB和LPS類似，需要形成AOG/TLR-4/MD-2復(fù)合體。TLR-4的341和362位賴氨酸對(duì)LPS/TLR-4/MD-2以及AOG/TLR-4/MD-2形成的復(fù)合體均

14、有很大影響，對(duì)LPS/TLR-4/MD-2復(fù)合體影響更大。MD-2122賴氨酸突變成精氨酸對(duì)AOG激活NF-κ3信號(hào)通路更為重要，可能是AOG、TLR-4和MD-2形成的復(fù)合體中的關(guān)鍵氨基酸。LPS和AOG單獨(dú)使用均能激活NF-κB信號(hào)通路，而聯(lián)合使用則抑制NF-κB信號(hào)通路。LPS和AOG和TLR-4、MD-2的結(jié)合位點(diǎn)明顯不同，我們推測(cè)LPS和AOG聯(lián)合使用時(shí)，可能需要和TLR-4/MD-2形成各自不同構(gòu)象的復(fù)合體，因需要和TLR/