乙酰肝素酶促進骨生成和骨折愈合的實驗研究.pdf

1、目的及研究背景
　　 骨質疏松及伴隨的骨折是病人致殘和致死的重要原因。乙酰肝素酶(HPSE)，一種促進血管生成的因子，特異地降解廣泛存在于細胞表面和細胞外基質中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖，參與多種惡性腫瘤轉移過程中血管生成。盡管如此，它在促進骨生長中的作用仍然不清楚。本實驗的目的:1.探討HPSE在刺激成骨細胞，促進成骨細胞增殖、分化和礦化的效果;2.比較HPSE刺激健康人和骨質疏松患者來源的成骨細胞增殖、分化和礦化的差異;3.觀察

2、HPSE在小鼠骨折模型中促進骨折愈合中的效果，并探討HPSE促進骨折愈合的機制。
　　 方法
　　 1.從人的血小板中提取HPSE(澳大利亞國立大學TORU實驗室提取、純化)。分別從7例健康成人和7例骨質疏松患者采集骨組織，分離成骨細胞并進行體外原代培養(yǎng)。HPSE原液(400μg/mL)最初由培養(yǎng)基(α-MEM)制備并用0.22μm的過濾器的消毒。將細胞以4000個/cm2的密度接種到25cm2的培養(yǎng)瓶，96孔板，和6孔

3、板上，經(jīng)過48小時的培養(yǎng)，用不同濃度的HPSE治療細胞，包括6μg/mL，3μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL，and0μg/mL的對照組。加入HPSE后，細胞再培養(yǎng)3，5或14天，取決于不同的實驗。在培養(yǎng)的第7天，更換細胞培養(yǎng)液并加入新鮮的HPSE。另外，骨形成蛋白-1(osteogenicprotein-1，OP-1，0.2μg/mL)用來替換HPSE作為陽性對照。將細胞接種到96孔板進行ATPLite檢

4、測，接種到6孔板進行骨礦化檢測，接種到25cm2的培養(yǎng)瓶中進行堿性磷酸酶活性檢測和流式細胞儀檢測。
　　 2.選用36只8-10周齡的Balb/C小鼠，隨機選取18只為HPSE治療組;另外的18只小鼠為對照組。所有小鼠以右后肢股骨為研究對緣，建立小鼠股骨骨折模型。治療組中將10ug/mL的HPSE注射到骨折部位，對照組中將相同劑量的生理鹽水注射到骨折部位。術后1周、2周和4周，獲取治療組及對照組標本，將骨折的股骨進行前后位和側位

5、的X線檢查，分別通過正側位X線片測量骨折部位骨痂的大小;將獲取的標本送到悉尼大學進行Micro-CT掃描并三維重建，測量組織總量、骨組織量等參數(shù);取股骨標本的股骨髁部位的松質骨進行骨小梁的重建和測量，觀察骨小梁數(shù)目、骨小梁厚度、骨小梁空隙以及骨小梁形態(tài)因子，評估HPSE在骨折愈合過程中的作用。將獲取的骨組織制成5μm的組織切片并行HE染色，光學顯微鏡下定性觀察骨折部位骨痂形成的情況;術后1周，收集治療組和對照組股骨骨折標本時，留取部分骨

6、組織，進行體外成骨細胞培養(yǎng)，將HPSE加入培養(yǎng)體系后，通過RT2-qPCR序列分析，觀察HPSE對小鼠成骨細胞中84個骨生成相關基因的調節(jié)作用。
　　 結果
　　 1.通過光學顯微鏡觀察后，用或不用HPSE治療的細胞均表現(xiàn)相同的成骨細胞表型，說明加入HPSE后，細胞形態(tài)未發(fā)生改變。與非治療的對照組相比，HPSE治療的成骨細胞的數(shù)量明顯增加，而不是細胞大小增加。與健康人標本來源的成骨細胞相比，骨質疏松標本來源的成骨細胞對H

7、PSE治療的更敏感，骨質疏松來源的成骨細胞數(shù)量的增加更明顯。ATPLite檢測結果顯示，經(jīng)過HPSE治療后，健康成骨細胞中ATP的增加多于骨質疏松成骨細胞，在培養(yǎng)的第5天，HPSE治療的兩種成骨細胞中ATP明顯增加并存在劑量依賴性。堿性磷酸酶檢測結果顯示，骨質疏松成骨細胞中ALP的活性水平高于健康成骨細胞，在培養(yǎng)的第5天，HPSE能顯著增加所有標本中的ALP活性并具有劑量依賴性。通過計算茜紅索-S(AR-S)結合的礦化結節(jié)來分析細胞中C

8、a的水平，在所有標本中，HPSE能顯著地增加成骨細胞Ca礦物質的形成，但是在相同的HPSE治療劑量下，骨質疏松標本中Ca含量的增加水平高于健康標本。ELISA法和流式細胞術分析結果顯示，HPSE對人成骨細胞的刺激作用和組蛋白的修飾有關，位于S28的組蛋白H3的磷酸化起主要作用，而不是位于S10的組蛋白H3的磷酸化或乙?；?。
　　 2.在HPSE對小鼠骨折模型中骨折愈合的實驗中，術后1周觀察兩組標本X線檢查顯示骨折周圍可見骨痂形成

9、，骨折線較為明顯;術盾2周觀察兩組標本骨折線均模糊不清，可見大量骨痂形成。術后4周，骨折線消失，通過X線判定骨折已愈合。前后位X線片測量顯示術后1周HPSE治療組標本的骨痂的最大橫徑與對照組標本骨痂的最大橫徑相比，顯著增加（3.26±0.13mmVS2.51±0.12mm，P=0.0321）;術后2周和4周前后位X線片測量結果，以及術后1周、2周和4周側位X線片測量結果比較無顯著的統(tǒng)計學意義。術后1周，組織切片HE染色顯示骨折周圍骨痂中

10、軟骨細胞較多，HPSE治療組標本中骨痂內(nèi)形成的微血管較多。術后2周，骨痂完全被骨折周圍的新骨和骨折中心的軟骨細胞占據(jù)。術后4周，在骨折部位新骨形成，形成明顯的骨橋連接，骨髓腔再通，骨痂部分被吸收。Micro-CT結果顯示術后1周的標本中，治療組的骨組織的含量（BV/TV）平均為9.24±0.9％，而對照組BV/TV平均為4.64±0.7％，兩組之間比較具有顯著的統(tǒng)計學意義。根據(jù)三維重建獲得結果分析，術后1周，骨小梁的數(shù)目(Tb.N)在治

11、療組和對照組標本平均為0.28±0.081/mm和0.1326±0.021/mm;骨小梁之間的間隙(Tb.SP)在治療組和對照組標本中的平均值分別為1.67±0.12mm和2.36±0.14mm;而骨小梁形態(tài)因子(Tb.Pf)在治療組和對照組標本中的平均值分別為-2.90±0.811/mm和4.97±1.641/mm;Tb.N、Tb.SP和Tb.Pf兩組之間比較具有顯著的統(tǒng)計學意義。術后2周的標本中，治療組的BV/TV平均為9.24±0

12、.4％，而對照組BV/TV平均為7.36±0.2％;兩組之間比較具有顯著的統(tǒng)計學意義。根據(jù)三維重建獲得結果分析，術后2周，Tb.N在治療組和對照組標本中平均為0.32±0.021/mm和0.28±0.031/mm，兩組之間比較具有顯著的統(tǒng)計學意義。Tb.SP、Tb.Pf及Tb.Th兩組之間比較無顯著的統(tǒng)計學意義。術后4周的標本中，Micro-CT對治療組和對照組標本測量的所有指標，如BV、BV/TV、TV、Tb.N、Tb.SP、Tb.P

13、f及Tb.Th等數(shù)據(jù)在兩組之間比較無顯著的統(tǒng)計學意義。在HPSE治療的標本中，BMP2，ALPL，CSF2，F(xiàn)GFR2和SMAD2均上調，表明HPSE刺激的普遍參與。經(jīng)HPSE刺激后，BMP6等17個基因表達上調，而RUNX2等8個基因表達下調。
　　 結論
　　 1.通過本研究結果顯示，HPSE能夠促進健康及骨質疏松來源的體外培養(yǎng)的人成骨細胞增殖、分化和礦化。
　　 2.在小鼠股骨骨折模型中，實驗結果初步證實H