人破牙細(xì)胞的體外培養(yǎng)及MMP-12表達(dá)的研究.pdf

1、乳恒牙替換是兒童口腔中的正常生理現(xiàn)象，乳牙牙根吸收、牙槽骨改建及恒牙萌出途徑形成，是乳牙替換和恒牙正常萌出的先決條件，在這些過(guò)程中破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)和破牙細(xì)胞(odontoclast，OD)起著重要作用。1982年Chambers和Magnus[1]首次在體外成功建立破骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，破骨細(xì)胞在體內(nèi)數(shù)量少，且為成熟的終末細(xì)胞，不能進(jìn)行細(xì)胞分裂或傳代，因此體外培養(yǎng)較困難。目前，多數(shù)研究顯示破牙細(xì)胞在形態(tài)、酶活性和代謝功

2、能等方面與破骨細(xì)胞相似，所以，破牙細(xì)胞的分離培養(yǎng)主要參考破骨細(xì)胞，多采用顱蓋骨消化法、四肢長(zhǎng)骨機(jī)械分離法、骨髓培養(yǎng)法等間接獲得破骨細(xì)胞樣細(xì)胞(osteoclast—like cell，OLC)，作為破牙細(xì)胞的替代細(xì)胞，進(jìn)行與牙體組織和骨組織吸收相關(guān)的研究[2]。本研究旨在通過(guò)酶消化法直接獲取破牙細(xì)胞，驗(yàn)證成熟破牙細(xì)胞分離培養(yǎng)的可行性，得到與體內(nèi)形態(tài)、功能更為接近的體外生活破牙細(xì)胞。 破牙細(xì)胞通過(guò)分泌多種酶降解細(xì)胞外基質(zhì)參與牙體組

3、織吸收過(guò)程，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是其中最主要的酶。目前已發(fā)現(xiàn)的MMPs家族成員近30種，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和底物特異性不同可分為7類(lèi)。基質(zhì)金屬蛋白酶-12(matrix metalloproteinase-12，MMP-12)又稱(chēng)為金屬?gòu)椥缘鞍酌?metalloelastase)，可獨(dú)立列為一類(lèi)，亦或歸類(lèi)于基質(zhì)溶解素，能降解包括彈力蛋白在內(nèi)的多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，是動(dòng)脈瘤和肺氣腫等病理狀態(tài)

4、下細(xì)胞侵襲和組織破壞的關(guān)鍵酶。有研究顯示MMP-12參與動(dòng)物破骨細(xì)胞性骨吸收，并能激活其他MMPs。目前對(duì)MMP-12的研究多集中于病理狀態(tài)。在生理狀態(tài)下如乳牙牙根生理性吸收過(guò)程中，MMP-12的生物學(xué)作用尚缺乏相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)牙根生理性吸收過(guò)程中破牙細(xì)胞MMP-12的表達(dá)情況，為闡釋該過(guò)程的形成機(jī)制提供理論依據(jù)。 目的：采用酶消化法在體外成功地分離、培養(yǎng)、鑒定人破牙細(xì)胞，驗(yàn)證成熟破牙細(xì)胞分

5、離培養(yǎng)的可行性，為后續(xù)探討其功能及調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)；通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)及免疫熒光技術(shù)確定乳牙牙根吸收過(guò)程中破牙細(xì)胞MMP-12的表達(dá)情況，為闡明牙根生理性吸收的機(jī)制提供理論依據(jù)。 材料與方法：①收集中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科就診的患兒因滯留而拔除的健康乳牙，拔出后即刻浸泡于α—最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(α—minimum essential medium，α—MEM)，低溫保存；離體健康吸收乳牙以含0.1％膠原酶(collagena

6、se)及0.2％分散酶(dispase)的α—MEM溶液37℃消化1h后，沖洗吸收根面，過(guò)濾、離心得到細(xì)胞沉淀，孵育培養(yǎng)。②人破牙細(xì)胞的組織形態(tài)學(xué)鑒定，包括倒置相差顯微鏡下觀(guān)察活細(xì)胞形態(tài)、蘇木素—伊紅染色(hematoxylin and eosin staining，HE染色)及抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartaric—resistant acid phosphatase staining，TRAP染色)，胞核用DAPI熒光染料進(jìn)行復(fù)染

7、。③人破牙細(xì)胞的功能活性鑒定，將分離所得的細(xì)胞與人牙硬組織薄片共培養(yǎng)，掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)下觀(guān)察牙薄片上形成的吸收陷窩。④利用兔抗人MMP-12的單克隆抗體，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和免疫熒光技術(shù)，鑒定乳牙牙根生理性吸收過(guò)程中破牙細(xì)胞MMP-12的表達(dá)情況。 結(jié)果：①體外成功分離、培養(yǎng)人破牙細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下觀(guān)察，離體細(xì)胞孵育2小時(shí)后，貼壁良好，偽足明顯，胞核數(shù)目不等，一個(gè)

8、至多個(gè)，清晰可見(jiàn)，胞漿內(nèi)可見(jiàn)吸收空泡。②HE染色可見(jiàn)大部分破牙細(xì)胞為多核巨細(xì)胞，胞核藍(lán)染；TRAP染色見(jiàn)破牙細(xì)胞胞漿布滿(mǎn)特異性的抗酒石酸酸性磷酸酶顆粒，呈特征性的酒紅色，大部分細(xì)胞具有多個(gè)胞核，熒光顯微鏡下呈藍(lán)色熒光。③通過(guò)SEM觀(guān)察，破牙細(xì)胞在人牙硬組織薄片上形成圓形、橢圓形吸收陷窩，陷窩邊界清晰，底部粗糙、膠原暴露。④免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)表明，體外培養(yǎng)人破牙細(xì)胞中MMP-12在胞漿中分別呈棕色、熒光紅色著色，核周著色較