谷氨酸受體在人破牙細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞活性的影響.pdf

1、目的：本研究擬建立體外分離培養(yǎng)人乳牙破牙細(xì)胞(odontoclast，OD)的方法，檢測(cè)谷氨酸受體(glutamate receptors)NR1、NR2B及GluR1在破牙細(xì)胞中的表達(dá)和分布；觀察NMDA受體拮抗劑革西平馬來(lái)酸鹽(MK801)對(duì)破牙細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化及硬組織吸收活性的影響。 方法：①收集兒童滯留乳牙，分別采用機(jī)械分離法、酶消化法及機(jī)械加酶消化法行破牙細(xì)胞分離培養(yǎng)。倒置顯微鏡、蘇木素—伊紅(Hematoxyl

2、in and Eosin，HE)染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate—resistant acid phosphatase，TRAP)染色鑒定破牙細(xì)胞，掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察破牙細(xì)胞吸收陷窩。②免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)谷氨酸受體NR1、NR2B及GluR1在人乳牙破牙細(xì)胞的分布及表達(dá)情況。③Fluo—3 AM熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)Ca2+，激光掃描共聚焦顯微鏡(

3、laser scanning confocal microscopy，LSCM)動(dòng)態(tài)檢測(cè)不同條件下破牙細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度水平變化。④異硫氰酸熒光素—鬼筆環(huán)肽(Phalloidin—FITC)標(biāo)記破牙細(xì)胞骨架，觀察MK801對(duì)破牙細(xì)胞肌動(dòng)蛋白環(huán)(F—actin ring)形成的影響。 結(jié)果：①與單純機(jī)械分離或酶消化法相比，機(jī)械加酶消化法可獲得較多破牙細(xì)胞。②倒置顯微鏡下，破牙細(xì)胞形態(tài)多樣，通過(guò)偽足伸縮變化進(jìn)行細(xì)胞遷移；HE染色破牙

4、細(xì)胞胞核大而明顯，胞核單個(gè)到數(shù)十個(gè)，核仁明顯，胞漿周圍偽足樣突起：TRAP染色破牙細(xì)胞胞漿呈酒紅色，胞核陰性不著色；掃描電鏡觀察到破牙細(xì)胞在牙片上形成吸收陷窩。③免疫細(xì)胞化學(xué)顯示NR1、NR2B及GluR1在破牙細(xì)胞胞漿部位出現(xiàn)棕黃色顆粒沉淀，以靠近胞核處著色明顯，胞核不表達(dá)。④MK801引起胞外Ca2+內(nèi)流減少，但不能完全阻斷Ca2+的內(nèi)流。⑤細(xì)胞培養(yǎng)6h，破牙細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)清晰，多數(shù)破牙細(xì)胞形成肌動(dòng)蛋白環(huán)，MK801能減少破牙細(xì)胞肌動(dòng)