食物過敏大鼠腸道屏障功能的變化.pdf

1、近年來,食物過敏(Food allergy,FA)的發(fā)病率呈逐步上升趨勢,已被視為一種嚴重的公共衛(wèi)生問題。但到目前為止,FA的發(fā)生機制還沒有完全被闡明,尤其是食物過敏過程中腸粘膜屏障功能的損傷機制還不清楚。在機械和生化等條件的作用下,腸粘膜屏障的完整性有可能遭到破壞,使TJs發(fā)生結(jié)構(gòu)重排或缺失,進而導致腸道通透性的異常改變。研究表明,腸道通透性的異常改變是FA發(fā)生的一個重要誘因。但對于FA過程中腸道屏障功能變化的分子基礎,國內(nèi)外尚未見深

2、入的研究報道。因此,研究食物過敏時腸道屏障功能的變化,并尋找與FA相關(guān)的腸道緊密連接分子顯得尤為重要。
　　 目的:
　　 研究食物過敏時腸道屏障功能的變化,并尋找與食物過敏相關(guān)的腸道緊密連接結(jié)構(gòu)基因,為RA的預防、診斷和治療提供新的理論基礎。
　　 方法:
　　 構(gòu)建挪威棕色(Brown Norway,BN)大鼠的食物過敏動物模型:實驗組每天給予1mg/mL的卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)1mL

3、灌胃;對照組每天給予O.1mmol/L的PBS1mL灌胃,共6周。建模期間,每7天1次分別給予每只大鼠一定量的乳果糖(Lactulose,L)和甘露醇(Mannitol,M)灌胃,收集24h尿液,通過高效液相色譜儀(High performance liquid chromatography,HPLC)檢測并計算尿液中L/M比值,動態(tài)檢測腸道通透性的變化。同時每7天1次分別從每只大鼠的尾靜脈取血,通過ELISA方法檢測血清中OVA特異性

4、IgE、IgG含量的動態(tài)變化。建模成功后,每組選取5只大鼠,經(jīng)乙醚麻醉處死后,分別剪取十二指腸、空腸上段、空腸下段、回腸上段及回腸下段各1cm。經(jīng)固定、包埋、切片、染色,光鏡下觀察腸道各段的病理變化,并對回腸部位的緊密連接結(jié)構(gòu)進行電鏡形態(tài)學觀察。同時于建模成功后,每組隨機選擇3只動物,處死后剪取整個回腸組織,運用基因芯片技術(shù)進行全基因表達變化的分析。經(jīng)基因芯片檢測后,選取6種關(guān)鍵基因:ZO-1、Occludin、Claudin-2、8、

5、9、15進行實時熒光定量PCR驗證其在兩個組中的表達變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.動物模型的評價
　　 17只實驗組BN大鼠中,根據(jù)建模成功的評判指標,11只建模成功,占總數(shù)的64.7％。血清OVA-IgE檢測結(jié)果顯示:不同時間測量的OVA-IgE含量差異有統(tǒng)計學意義(F=746.523,P＜0.001);測量時間和組別間有交互作用(F=134.238,P＜0.001);組間效應比較分析也顯示兩組間差異有統(tǒng)計學

6、意義(F=165.464,P＜0.001);每個時間點兩組比較,第6周兩組OVA-IgE差異有統(tǒng)計學意義(F=686.37,P＜0.001)。血清OVA-IgG檢測結(jié)果顯示:不同時間測量的OVA-IgG含量差異有統(tǒng)計學意義(F=30.797,P＜0.001)。測量時間和組別間有交互作用(F=42.274,P＜0.001);組間效應比較分析也顯示兩組間差異有統(tǒng)計學意義(F=221.774,P＜0.001)。每個時間點兩組比較,3-6周兩組

7、OVA-IgG差異均有統(tǒng)計學意義(F分別為38.96,93.30,155.08,454.70;P值均小于0.001)。光鏡下觀察腸組織結(jié)構(gòu):對照組腸絨毛排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰完整,而實驗組十二指腸至回腸下段均不同程度地出現(xiàn)腸絨毛結(jié)構(gòu)損傷、缺失和固有層大量炎性細胞浸潤的現(xiàn)象。
　　 2.腸道通透性的變化
　　 尿液中L/M結(jié)果顯示:不同時間測量的L/M含量差異有統(tǒng)計學意義(F=1855,P＜0.001)。測量時間和組別間有交互

8、作用(F=394.494,P＜0.001)。組間效應比較分析也顯示兩組間差異有統(tǒng)計學意義(F=2127,P＜0.001)。每個時間點兩組比較,2-6周兩組差異均有統(tǒng)計學意義(F值分別為:78.37,1121,937.94,3238,3290;P值均小于0.001)。
　　 3.腸道TJ結(jié)構(gòu)的形態(tài)學及相關(guān)分子變化
　　 經(jīng)透射電鏡觀察,對照組回腸的微絨毛排列整齊,結(jié)構(gòu)完整,細胞間TJs相互融合,各種細胞器排列規(guī)則。而實驗組

9、回腸部位絨毛腫脹、脫落,細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)擴大,細胞結(jié)構(gòu)紊亂,細胞器出現(xiàn)明顯變形破壞?；蛐酒瑱z測發(fā)現(xiàn),食物過敏大鼠腸道出現(xiàn)明顯變化的TJ結(jié)構(gòu)基因主要有:Claudin-2、6、8、9、11、15、18、22。其中Claudin-9、15、18、22上調(diào),其它下調(diào)。而ZO-1和Occludin的mRNA水平與對照組相比沒有明顯變化。選取的6種基因經(jīng)熒光定量PCR分析,上調(diào)的基因為:Claudin-9;下調(diào)的基因為:ZO-1、Claudi

10、n-2、Claudin-8、Claudin-15;其中Oceludin在兩組樣本中表達無明顯變化。
　　 結(jié)論:
　　 1.食物過敏時抗原特異性的IgG和IgE含量均升高,IgG的升高發(fā)生在食物過敏早期。
　　 2.食物過敏大鼠從十二指腸到回腸下段均不同程度地發(fā)生了炎癥變化。
　　 3.致敏大鼠腸道通透性的增加發(fā)生在食物過敏早期。
　　 4.與食物過敏相關(guān)的TJ結(jié)構(gòu)基因主要為跨膜蛋白Claudin