桂皮醛對CVB3誘發(fā)的小鼠病毒性心肌炎的作用機制研究.pdf

1、病毒性心肌炎(Viral Moycarditis,VMC)是臨床多發(fā)病,目前尚缺乏有效治療藥物和措施,嚴重的威脅人們的健康。腸道病毒中的柯薩奇病毒B組3型(Coxsackie B virus 3,CVB3)是誘發(fā)VMC的主要病原體,可直接導致心肌細胞病變和死亡,并激活內源性阿片系統(tǒng),引起循環(huán)中β-內啡肽(β-endogenous opioid peptide,β-EP)水平升高及心肌細胞膜上β-EP受體結合容量改變[1],通過神經(jīng)內分泌

2、-免疫網(wǎng)絡,激活核轉錄因子(nuclear factor kappa B,NF-κB);CVB3還可通過Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4),激活TLR4-NF-κB信號轉導途徑,激活NF-κB,引起一系列的炎癥應答,造成心肌細胞進一步損傷,使VMC進一步發(fā)展或出現(xiàn)充血性心力衰竭。因此,研究藥物抑制CVB3在體內的復制、降低β-EP水平、抑制TLR4-NF-κB信號轉導途徑引起的炎癥反應對VMC的治療作

3、用,不僅對闡明VMC的病理轉歸具有重要意義,而且為發(fā)現(xiàn)和開發(fā)抗VMC的有效治療藥物提供新的治療思路。桂皮醛(Cinnamaldehyde,CA)是樟科植物肉桂(Cinamonum cassia Presl)的干皮及樹皮經(jīng)水蒸餾得到的揮發(fā)油——肉桂油(Cinnamaon oil,OC)的主要成分,藥典規(guī)定其含量大于75％[3]。已有的藥理學研究表明,CA具有抗真菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[4-6],對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervo

4、us system ,CNC)以及免疫系統(tǒng)有一定的影響[7-8]。K. Hayashi.等[9](2007)研究證實在體內、外對流感A/PR/8病毒具有抑制作用;到2008年Youn HS等[10]進一步證實CA對體外LPS誘發(fā)TLR4-NF-κB信號轉導途徑具有顯著抑制作用。我們前期的研究證實[11]OC和CA對CVB3誘發(fā)性小鼠VMC具有明顯治療作用,其治療效果優(yōu)于黃芪注射液和病毒唑;并證明OC中抗VMC的藥理活性成分是CA。但是,

5、CA對CVB3誘發(fā)性VMC的作用機制尚不清楚;由于CA的化學性質不穩(wěn)定,其在體內可迅速被氧化為肉桂酸(Cinnamic acid,CD),其血漿半衰期為9min ,那么CA是通過其本身還是體內代謝產物即CD對VMC發(fā)揮治療作用的也不明確。對此,本課題就以CD為對照組,從體內外兩方面展開研究。
　　研究目的：
　　首先探討CA、CD體內、外抗CVB3的作用與作用機制；其次觀察CA、CD對CVB3誘發(fā)性VMC小鼠心肌細кOR水平

6、以及TLR4-NF-κB信號轉導途徑等指標的影響，評價CA治療VMC的作用機制。
　　研究內容：
　　第一部分：體外實驗
　　1、CA和CD的細胞毒性實驗
　　1.1方法培養(yǎng)原代心肌細胞，心肌細胞以1×105/孔接種于24孔板培養(yǎng)。待細胞生長成片后，加入0－1000μM含有CA、CD的培養(yǎng)液孵育72h。同時設置空白對照組，比較各組細胞病變效應(cytopathiceffect，CPE)、MTT法檢測細胞存活率(n

7、=3)。
　　1.2結果CA對心肌細胞的LogIC50為－4.125。0.1-1000μMCA呈劑量依賴性抑制心肌細胞的活性，0.1，1，10，100μMCA對心肌細胞存活率分別為70％，54％，13％和0％。而1000μMCD對心肌細胞未見CPE，該劑量組的心肌細胞存活率為97％。0.1-1000μMCD的心肌細胞存活率明顯高于CA各組（P＜0.01）。
　　1.3結論CA對心肌細胞的LogIC50為－4.125。大于0.

8、1μM的CA對心肌細胞具有毒性；CD在0.01-1000μM的濃度范圍未見細胞毒性。提示CA對心肌細胞具有顯著毒性，分析其毒性可能與其醛基相關。
　　2、CA和CD體外抗CVB3的作用研究
　　2.1方法心肌細胞以1×105/孔接種于24孔板培養(yǎng)。待細胞生長成片后，接種CVB3，孵育后1h給予0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000μMCA和CD，72h后觀察CPE，在HeLa細胞上測定病毒滴度，設立CVB3

9、病毒和空白對照組(n=3)，確定量效關系。
　　2.2結果10－1000μMCD各組呈劑量依賴性抑制心肌細胞中的病毒滴度（P＜0.01），細胞存活率高于CA各組和CVB組（P＜0.01）。100－1000μMCA組病毒滴度低于CVB組（P＜0.01），而細胞存活率與CVB組無統(tǒng)計學差異（P＞0.01）。
　　2.3結論10-1000μMCD可降低感染CVB3心肌細胞的病毒滴度，對心肌細胞具有保護作用；100-1000μMCA

10、在體外具有抗CVB3病毒的作用，但同時對宿主細胞也產生明顯毒性。
　　3、CA和CD體外抗CVB3的作用機制研究
　　3.1方法心肌細胞以1×105/孔接種于24孔板培養(yǎng)。細胞生長成片后，分別于接種CVB3前1h（－1h）、接種同時（0h）和接種后1h（1h）給予100μMCA、100μMCD各100μL，同時設CVB3及空白對照組；孵育72h，觀察CPE，MTT測定細胞存活率，并進行病毒中和抗體、免疫熒光實驗和電鏡觀察，探

11、討各試藥的抗病毒作用機制。
　　3.2結果接種CVB3－1h、0h和1h分別給予100μMCD100μL，其病毒滴度顯著低于CVB組（P＜0.01），細胞存活率高于CA組和CVB組（P＜0.01），三組不同接種時間CVB3的CD組之間，組間比較無顯著差異（P＞0.05），提示CD對CVB3感染無預防性保護作用，電鏡和免疫熒光實驗顯示CD對CVB3有直接滅活和抑制病毒在細胞內的復制作用。接種CVB301h給予CA，其病毒滴度低于CV

12、B組（P＜0.01），但細胞存活率與CVB組無顯著性差異（P＞0.01）。
　　3.3結論CA在體外可直接滅活CVB3，但對心肌細胞具有明顯毒性；CD可直接殺滅CVB3和抑制CVB3在細胞內的復制，但對CVB3感染無預防作用。
　　第二部分：體內實驗部分
　　1、VMC小鼠心肌組織中кORmRNA和蛋白表達的變化
　　1.1方法50只BALB/c小鼠以10－5.09IU/mLCVB3i.p100μL誘導小鼠VMC

13、模型，在隔離實驗室飼養(yǎng)。另取15只BALB/c小鼠同法接種100μL不含病毒的Eagle液。分別在病毒感染后第5、7、14、21、28天，隨機取3只小鼠，處死，留取心肌組織。采用RT-PCR和WESTERNBLOT技術檢測CVB3感染后各時間點小鼠心肌組織中κORmRNA和蛋白質的表達水平。
　　1.2結果CVB3感染后第5、7、14、21天，κORmRNA表達量顯著高于正常組（P＜0.01）；而κOR蛋白質的表達量在CVB3感染

14、后第7、14、21天明顯高于正常組（P＜0.05）。
　　1.3結論首次發(fā)現(xiàn)CVB3誘導性VMC小鼠心肌細胞的κOR基因和蛋白質水平明顯上調，提示κOR參與了VMC的病理過程。
　　2、探討CA治療VMC小鼠的作用機制
　　2.1方法150只BALB/c小鼠分為5組（n=30），100μL10－5.09IU/mLCVB3i.p誘導小鼠VMC模型，在隔離實驗室飼養(yǎng)。另取16只BALB/c小鼠作為對照組，接種100μL不含

15、病毒的Eagle液。于接種病毒后72h各組分別給藥，對照組i.p2500mg/kgNS；CVB3組i.p2500mg/kgNS；納絡酮（NXL）組i.p2mg/kg；U50，488H組i.p30mg/kg；CA組i.p30mg/kg；CD組i.p30mg/kg，連續(xù)給藥至21天。病毒感染后第10天(n=8)和21天、各組隨機取小鼠稱體重，摘眼球取血后處死，取心臟，計算心臟重量/體重比；心臟一分為二，一半用作κORmRNA、CVB3mRN

16、A、TLR4mRNA的RT-PCR檢測和WESTERNBLOT技術檢測κOR和TLR4蛋白質的表達水平；另一半作石蠟切片，HE染色和制片作NF-κB免疫組化染色；以ELASA試劑盒檢測血漿中β-EP水平；整個實驗期間觀察紀錄小鼠累積死亡數(shù)及存活時間。
　　2.2結果與CVB3組比較，CA組與U50，488H組可顯著延長VMC小鼠中位生存時間，降低心臟指數(shù)；對CVB3感染后第10、21天的病理評分，κORmRNA、TLR4mRNA和

17、蛋白質的表達水平均呈現(xiàn)抑制作用（P＜0.05-0.01）；對感染21天血漿中β-EP水平亦呈抑制作用。NXL組可延長VMC小鼠中位生存時間，降低感染后第10、21天血漿中β-EP水平和第21天小鼠心肌病理病變（P＜0.05）。CD組對感染后第21天小鼠心肌病理病變較CVB3組明顯降低（P＜0.05）。CA組和CD組可顯著降低病毒感染后第10、21天CVB3mRNA表達（P＜0.01），且感染第14天CA組的病理評分輕于CD組；這提示CA