第三種氣體信號分子H2S在LPS所致大鼠ALI中的作用及其機制初探.pdf

1、目的：急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一組除心源性因素以外，由其它各種致病因素造成的急性彌漫性肺泡上皮、肺微血管內(nèi)皮和肺間質(zhì)損傷，從而引起以彌漫性肺泡和間質(zhì)水腫，臨床表現(xiàn)為急性、進行性、缺氧性呼吸衰竭的肺部炎癥綜合征，進而可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。肺動脈高壓(pulmonaryartery hypertension，PAH)為

2、其血流動力學特征，它是促進肺泡水腫和間質(zhì)水腫的重要因素之一。臨床上造成ALI的原因中，細菌內(nèi)毒素占有著重要的地位，其中又以革蘭氏陰性細菌內(nèi)毒素為主導，而其內(nèi)毒素的主要活性成份為脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是導致ALI的主要因素。而中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)則可能是造成過度炎性反應的元兇。
　　 在機體遭到LPS入侵后，將會激活體內(nèi)的酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生

3、大量的自由基，同時出現(xiàn)自由基清除系統(tǒng)的活性下降，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)則是自由基清除系統(tǒng)的代表，它的活性反映了機體抗氧化的能力。而產(chǎn)生的自由基則會攻擊生物膜，使膜脂質(zhì)過氧化，造成細胞損傷。在氧化與抗氧化反應中丙二醛(malondialdehyde，MDA)是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，它的高低可以間接地反映細胞受自由基攻擊后所致?lián)p傷的程度。
　　 同時對于組成機體的組織細胞而言，細胞的增值、

4、分化、凋亡始終貫穿于生命的整個過程并有序的進行著。細胞內(nèi)存在著抗凋亡因子[如：B細胞淋巴瘤2基因(B-cell lymphoma-2 gene，Bcl-2)等]及促凋亡因子(如Fas等)，他們相互作用制約著，維持著恰當?shù)膭討B(tài)平衡。但當機體受到LPS入侵這一刺激后，兩者之間適當?shù)膭討B(tài)平衡被破壞，凋亡因子占據(jù)了主導地位，出現(xiàn)細胞凋亡加速，組織損傷加重。
　　 PMN在肺內(nèi)過度募集、黏附、活化、遷移及延遲凋亡是導致過度炎性反應的關鍵，

5、而血管內(nèi)皮細胞表面的黏附分子[如：細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecules，ICAM-1)]及CD11b表達的上調(diào)則在其過度度募集、黏附、遷移過程中起著重要的作用。而CD11b不但可以促進髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)與PMN結合以及隨后的PMN脫顆粒和超氧化物的產(chǎn)生，而且還可以增強MPO的延遲PMN凋亡作用。
　　 盡管目前對ALI機制的認知有了很大

6、的進步，但至今臨床上對如何有效的阻止ALI進展成為ARDS或MODS，仍未找到切實有效的方法。而ARDS和MODS在全球的病死率也仍居高不下。因此，深入探討ALI的發(fā)病機制，將ARDS消滅在萌芽狀態(tài)，即如何防治ALI的發(fā)生與發(fā)展，是當今該領域亟待解決的重要課題。
　　 硫化氫(bydrogen sulfide，H2S)是新近被發(fā)現(xiàn)的，除了一氧化氮(nitrogen monoxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxid

7、e，CO)外已被證實的人體能自身生成，且有著多種病理生理作用的生物學功能的第三種內(nèi)源性氣體信號分子。雖然現(xiàn)在已證實了H2S在對抗內(nèi)毒素休克時的肺損傷及升高的肺動脈壓中起到了一定的作用，但尚缺乏足夠的認識，因此我們做了本實驗，試圖從以下兩個方面來初步探討其作用機制：1、H2S在LPS所致急性肺損傷中的作用；2、H2S在抗LPS所致急性肺損傷時對PMN的影響。
　　 一 H2S在LPS所致急性肺損傷中的作用
　　 方法：將2

8、10只大鼠，隨機分為6組，每組35只，其中7只大鼠用于測量其mPAP，再分別取28只于給藥后4h或8h進行觀察(其中，14只用于支氣管肺泡灌洗，另14只不行支氣管肺泡灌洗)。①鹽水對照組(Control組)：氣管內(nèi)滴注無熱原生理鹽水(normal saline，NS，200μl·只-1)；②LPS組：氣管內(nèi)滴注LPS(200μg·200μl-1·只-1)；③LPS+NaHS(H2S供體)組：氣管內(nèi)滴注LPS前15 min經(jīng)腹腔注射0.5

9、ml NaHS(28μmol·kg-1)：@LPS+PPG(CSE抑制劑)組：氣管內(nèi)滴注LPS前15 min經(jīng)腹腔注射0.5ml PPG(45μmol·kg-1)；⑤NaHS組：氣管內(nèi)滴注NS前15 min經(jīng)腹腔注射0.5ml NaHS(28μmol·kg-1)；⑥PPG組：氣管內(nèi)滴注NS前15 min經(jīng)腹腔注射0.5ml PPG(45μmol·kg-1)。
　　 各組均于4h或8h時經(jīng)頸總動脈放血處死動物，再行支氣管肺泡灌洗(

10、bronchoalveolar lavage，BAL)，而后收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。沒有進行BAL的動物摘取全肺稱重后，留取肺組織。采用生化方法檢測肺組織SOD活性和MDA含量；免疫組織化學技術檢測肺組織Bcl-2、Fas蛋白表達變化；光鏡下觀察肺組織形態(tài)學變化并計算肺泡損傷數(shù)比值作為肺損傷的組織學定量評價指標(index of quantitative assessm

11、ent，IQA)，右心導管法測定平均肺動脈壓。
　　 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示，用SPSS13.0軟件進行分析。對PMN數(shù)量采用多樣本均數(shù)比較的秩和檢驗及兩兩比較的秩和檢驗，在各時間點所有變量的差異用單因素方差分析(one-way ANOVA)來檢驗，先進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，滿足方差齊性要求時組間比較采用LSD法，不滿足方差齊性要求時組間比較采用Dunnett's T3法。雙變量的相關分析用直線相關分析法分析。以P

12、<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：LPS組與對照組相比，大鼠的肺系數(shù)、BALF中的蛋白含量、IQA均增大，MDA含量顯著增加，SOD活性降低，光鏡下可見肺組織出現(xiàn)損傷。PPG+LPS組與LPS組相比，大鼠的肺系數(shù)、肺組織和BALF中的蛋白含量、IQA增大的更為顯著，MDA含量明顯增加，SOD活性降低，光鏡下可見肺組織損傷也更重；NaHS+LPS組與上述兩組(PPG+LPS組和LPS組)相比大鼠的肺系數(shù)、肺組織和BALF中的

13、蛋白含量、IQA均明顯減小，MDA含量減少，SOD活性升高，光鏡下見肺組織損傷較上兩組也明顯減輕。與對照組相比，LPS組大鼠肺組織中Bcl-2蛋白表達下調(diào)，(P均<0.01)；Fas蛋白表達的陽性信號明顯增多，(P均<0.01)。與LPS組相比，LPS+NaHS組大鼠肺組織Bcl-2蛋白表達上調(diào)，(P均<0.01)，LPS+NaHS組大鼠肺組織Fas蛋白表達明顯減少，(P均<0.01)；LPS+PPG組大鼠肺組織Bcl-2蛋白表達下調(diào)，

14、(P均<0.01)，LPS+PPG組大鼠肺組織Fas蛋白表達顯著增多，(P均<0.01)。PPG+LPS組大鼠mPAP>LPS組>NaHS+LPS組>對照組，NaHS組和PPG組大鼠的mPAP與對照組相比，無顯著性差異(P均>0.05)
　　 以上結果表明：H2S具有抗LPS所致的急性肺損傷的作用；并且是通過降低升高的肺動脈壓、抗氧化、下調(diào)肺組織Fas蛋白表達、上調(diào)Bcl-2蛋白表達來抗LPS所致的急性肺損傷。
　　 二

15、 H2S在抗LPS所致急性肺損傷時對PMN的影響
　　 方法：將112只大鼠，隨機分為4組，每組28只(其中，14只用于支氣管肺泡灌洗，另14只不行支氣管肺泡灌洗)，分別于給藥4h或8h后進行觀察。①鹽水對照組(Control組)：氣管內(nèi)滴注無熱原生理鹽水(normal saline，NS，200μl·只-1)；②LPS組：氣管內(nèi)滴注LPS(200μg·200μl-1·只-1)；③LPS+NaHS(H2S供體)組：氣管內(nèi)滴注LP

16、S前15 min經(jīng)腹腔注射0.5ml NaHS(28μmol·kg-1)；④LPS+PPG(CSE抑制劑)組：氣管內(nèi)滴注LPS前15 min經(jīng)腹腔注射0.5ml PPG(45μmol·kg-1)。動物模型的復制同第一部分。采用生化方法檢測肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性；光鏡下計數(shù)BALF中PMN數(shù)目；免疫組織化學染色觀察肺組織ICAM-1蛋白表達的變化；流式細胞學方法檢測血PMN CD11b。
　　 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s

17、)表示，用SPSS13.0軟件進行分析。對PMN數(shù)量采用多樣本均數(shù)比較的秩和檢驗及兩兩比較的秩和檢驗，在各時間點所有變量的差異用單因素方差分析(one-way ANOVA)來檢驗，先進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，滿足方差齊性要求時組間比較采用LSD法，不滿足方差齊性要求時組間比較采用Dunnett's T3法。雙變量的相關分析用直線相關分析法分析。以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：在同一測定時間點，大鼠BALF中PMN的

18、數(shù)目，LPS+PPG組>LPS組>LPS+NaHS組>對照組相，且有統(tǒng)計學意義；血PMN CD11b與BALF中PMN計數(shù)的相關性分析結果顯示，兩者存在顯著正相關(r=0.789，P<0.01)；肺組織中MPO活性也與血PMN CD11b表達的變化出現(xiàn)了同趨勢的改變。與對照組相比，LPS組大鼠肺組織中ICAM-1蛋白含量及表達均表現(xiàn)為上調(diào)；NaHS治療組大鼠肺組織中的ICAM-1蛋白含量及表達則出現(xiàn)了降低，而LPS+PPG組大鼠肺組織中

19、ICAM-1陽性信號表達較LPS治療組增多。
　　 以上結果表明：H2S對LPS誘導的PMN在肺組織內(nèi)聚集、黏附、激活及延遲凋亡的抑制作用是通過減少ICAM-1、CD11b、MPO活性的表達來降低PMN與血管內(nèi)皮細胞間的相互作用，從而發(fā)揮其抗氧化、抑制PMN在肺內(nèi)的大量聚集、黏附，改善了肺微血管的通透性、減少了肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)的滲出等，起到了保護肺組織的作用。
　　 結論：1、H2S具有抗LPS所致的急性肺損傷的作用。