內源氣體信號分子(NO和H2S)對家禽骨骼肌蛋白代謝的調控研究.pdf

1、在機體中，骨骼肌占有相當大的比例并發(fā)揮著巨大的調控作用，因此，骨骼肌的生長發(fā)育不僅關系著畜禽機體的健康，還影響著畜禽生產性能的提高。另外，由于骨骼肌是機體巨大的蛋白周轉代謝庫，所以蛋白合成代謝及分解代謝決定著骨骼肌生長發(fā)育。本研究選擇C2C12細胞（小鼠）、成肌細胞（雞）及肉雞作為研究對象，分別就糖皮質激素、一氧化氮（NO）及硫化氫（H2S）氣體信號分子對骨骼肌發(fā)育的作用機制展開研究。
　　第一部分：
　　糖皮質激素對骨骼肌

2、蛋白代謝的調控研究
　　肌抑素（myostatin，MSTN）是肌肉生長發(fā)育的重要調控因子，影響著骨骼肌細胞內的蛋白合成及分解代謝。本研究利用地塞米松（DEX）處理 C2C12細胞，初步探索肌抑素蛋白的表達規(guī)律。結果發(fā)現，DEX處理24 h后，肌抑素的mRNA豐度出現顯著上調；當DEX處理36 h時，肌抑素的蛋白表達水平顯著升高。同時，研究發(fā)現DEX處理顯著抑制C2C12細胞的蛋白合成率及mTOR/p70S6K信號通路；而參與蛋白

3、分解代謝的泛素蛋白酶體相關因子（FoxO1、FoxO3a及MURF1、Atrogin-1）得到激活。因此，我們推測肌抑素參與了C2C12細胞的蛋白合成及分解代謝。試驗接下來采用肌抑素抑制劑（Follistatin，Fs）處理，在培養(yǎng)并分化的C2C12細胞中，同時加入DEX及肌抑素抑制劑處理。結果表明，肌抑素抑制劑處理能夠顯著抑制DEX對肌抑素的激活以及蛋白分解相關因子的激活，而對蛋白合成率及mTOR、p70S6K的作用不顯著。總之，在骨

4、骼肌發(fā)育早期階段，糖皮質激素依賴于肌抑素促進骨骼肌蛋白分解代謝，影響骨骼肌的生長發(fā)育；并且，肌抑素不是糖皮質激素抑制蛋白合成代謝的關鍵因子。
　　第二部分：
　　氣體信號分子NO骨骼肌蛋白代謝的調控機制研究
　　氣體信號分子NO參與機體多種生理活動，如血管平滑肌的舒張等，對機體的正常運轉發(fā)揮著重要作用，而精氨酸是內源性NO的重要前體物質，因此，本研究對L-Arg-NO途徑在骨骼肌蛋白代謝中的調控作用進行了研究。

5、　　C2C12細胞：首先，L-Arg處理不僅顯著緩解DEX處理對骨骼肌細胞的蛋白合成抑制作用，同時，相比于對照組，L-Arg處理能夠顯著上調C2C12細胞的蛋白合成率、mTOR（Thr2446）和p70S6K（Thr389）的磷酸化水平。其次，L-NAME（NOS抑制劑）處理能夠顯著抑制C2C12細胞的蛋白合成率、mTOR（Thr2446）和p70S6K（Thr389）的磷酸化；而L-Arg的添加能夠緩解L-NAME對蛋白合成率、mTO

6、R（Thr2446）和p70S6K（Thr389）磷酸化水平的抑制作用。另外，研究發(fā)現L-NAME能夠顯著抑制NO的產生及TNOS的活性，并且L-Arg能夠緩解了L-NAME對NO產生的抑制作用。因此，我們推測L-Arg-NO途徑參與了C2C12細胞的蛋白合成代謝過程。最后，研究采用SNP（NO供體）處理C2C12細胞，NO能夠促進骨骼肌蛋白合成代謝，通過激活p-mTOR（Thr2446）、p-p70S6K（Thr389）及p-4E-B

7、P1（Thr37/46）相關因子的表達；另外， SNP處理后，細胞及培養(yǎng)基內NO的濃度顯著升高?？傊贑2C12細胞上，精氨酸依賴于NO氣體信號分子，激活mTOR/p70S6K信號通路促進蛋白合成代謝；另外，骨骼肌蛋白合成代謝的激活依賴于p-mTOR（Thr2446）的磷酸化而不是p-mTOR（Ser2448）和p-mTOR（Ser2481）。
　　成肌細胞（雞）：研究發(fā)現，不同濃度的 L-Arg處理均能一定程度地抑制成肌細胞蛋

8、白合成率。同時，L-Arg（400μM）處理組蛋白合成率及p70S6K的磷酸化顯著下調，蛋白分解相關因子MuRF1及Atrogin-1也受到顯著抑制。并且，在L-Arg處理下，添加L-NAME處理能夠顯著緩解L-Arg對成肌細胞（雞）蛋白合成及分解代謝的抑制作用。因此，我們猜測L-Arg-NO途徑參與了成肌細胞（雞）蛋白合成及分解代謝過程。最后，試驗采用SNP處理成肌細胞（雞），結果表明，SNP通過抑制p70S6K的磷酸化，顯著抑制骨骼

9、肌蛋白合成代謝，同時，顯著地抑制了蛋白分解相關因子的表達。總之，在成肌細胞（雞）中，L-Arg依賴于NO氣體信號分子對蛋白合成及分解代謝呈現顯著的抑制作用。
　　肉仔雞：
　　在上述細胞試驗中，L-Arg-NO途徑均參與了骨骼肌的蛋白代謝過程。因此，本研究假設了L-Arg-NO途徑同樣參與肉仔雞的骨骼肌蛋白合成代謝過程。試驗首先研究了L-NAME處理對肉仔雞生產性能的影響，結果表明，L-NAME（0.05％）能夠顯著抑制肉仔

10、雞日增重及空腸、回腸的發(fā)育；而對胸肌及其指數無顯著影響，腿肌重量呈現下調的趨勢但腿肌指數無顯著變化。接著，研究采用日糧添加1% L-Arg處理，結果表明，精氨酸能夠顯著緩解L-NAME對肉雞的日增重及肉仔雞胸、腿肌重的抑制，而對胸、腿肌指數的影響不顯著；同時，L-Arg一定程度緩解了L-NAME對胸肌蛋白合成率及mTOR、p70S6K的抑制作用，除p70S6K的磷酸化外，均不顯著；而在腿肌中，L-Arg顯著上調了蛋白合成率、mTOR、p

11、70S6K蛋白水平。最后，進行了嗎多明（NO供體）處理肉仔雞試驗，結果表明，嗎多明處理能夠顯著緩解 L-NAME對肉雞的日增重及回腸發(fā)育的抑制作用，而對胸腿肌發(fā)育作用不顯著；在胸腿肌中，嗎多明處理顯著緩解了L-NAME對蛋白合成率、mTOR、p70S6K蛋白水平上的抑制作用?？傊?，在肉仔雞中，精氨酸至少部分依賴于NO氣體信號分子調控肉雞生長發(fā)育；并且，在此過程中，肉仔雞的生長發(fā)育并不主要依賴于骨骼肌的生長發(fā)育。
　　第三部分：

12、r>　　氣體信號分子H2S對骨骼肌蛋白合成代謝調控機制的研究
　　硫化氫（H2S）是機體內重要的氣體信號分子，能夠參與眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展及痊愈等過程，其具有重要的生理學意義。本研究首先利用DEX處理成肌細胞（雞）建立蛋白合成下調模型，添加RU486處理能夠顯著阻斷DEX對成肌細胞（雞）蛋白合成代謝的抑制作用，這表明DEX通過糖皮質激素受體（GR）對蛋白合成代謝進行相應的調控；而添加L-Cys處理能夠顯著緩解DEX對mTOR/p7

13、0S6K信號通路、蛋白合成率、CSE（胱硫醚-γ-裂解酶）的抑制作用。另外，在L-Cys處理下，添加PAG（CSE抑制劑）處理能夠顯著抑制成肌細胞（雞）的蛋白合成率、mTOR、p70S6K的磷酸化及CSE的蛋白表達。因此，我們推測H2S參與了成肌細胞（雞）蛋白合成代謝過程。試驗接著檢測了NaHS（H2S供體）對成肌細胞（雞）蛋白合成代謝的調控，結果發(fā)現，NaHS處理能夠顯著升高培養(yǎng)基內H2S的濃度；并且，顯著緩解了DEX對mTOR/p7

14、0S6K信號通路、蛋白合成率、CSE的抑制作用。最后，為了進一步證明H2S對蛋白合成代謝的調控作用，試驗采用 Insulin處理建立蛋白合成代謝上調模型，Insulin處理顯著上調成肌細胞（雞）蛋白合成代謝并呈劑量依賴性；添加PAG處理能夠顯著抑制Insulin對成肌細胞（雞）的蛋白合成率、mTOR、p70S6K的磷酸化及CSE蛋白表達的激活作用?？傊瞧べ|激素及胰島素依賴于CSE/H2S，調控mTOR/p70S6K信號通路影響骨骼肌

15、蛋白合成代謝過程。
　　總之：
　　（1）在生長發(fā)育早期，肌肉生長抑制素信號通路參與了糖皮質激素誘導的骨骼肌蛋白分解代謝。
　　（2）在C2C12細胞中，L-Arg-NO促進骨骼肌細胞的蛋白合成代謝；在成肌細胞（雞）上，L-Arg-NO抑制了肌細胞的蛋白合成及分解代謝；在肉仔雞上，L-Arg-NO調控肉仔雞的生產性能不是直接通過促進骨骼肌的生長發(fā)育實現的。
　?。?）糖皮質激素及胰島素依賴于CSE/H2S，激活m