河北省致手足口病病原譜及病原基因特征分析.pdf

1、目的：了解河北省手足口病(HFMD)不同病原的流行特征，明確其病原譜及主要病原的基因特征，為河北省手足口病的監(jiān)測和預(yù)防控制工作提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、通過流行病學(xué)調(diào)查，采集HFMD臨床診斷病例的糞便、肛拭子、咽拭子、皰疹液和腦脊液標(biāo)本。
　　 2、針對腸道病毒(EV)5′端非編碼區(qū)保守基因序列以及EVVP1至2A區(qū)基因序列設(shè)計EV通用引物和型特異性引物，通過RT-PCR擴(kuò)增檢測HFMD臨床診斷病例

2、的標(biāo)本，并對病原進(jìn)行分型。
　　 3、將RT-PCR檢測為EV陽性的HFMD實(shí)驗(yàn)室診斷病例標(biāo)本接種RD細(xì)胞分離病毒；通過RT-PCR法對出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)的標(biāo)本進(jìn)行毒株鑒定。
　　 4、針對主要病原EV71和CA16的VP1區(qū)全核苷酸序列設(shè)計引物，用RT-PCR擴(kuò)增18株EV71、9株CA16的VP1區(qū)，測定其序列，用DNASTAR軟件進(jìn)行核苷酸序列同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，對河北省EV71和CA16分離株的基因亞

3、型進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、采用RT-PCR法共檢測HFMD臨床診斷病例1990份標(biāo)本，1296份標(biāo)本EV陽性，陽性率為65.13％，其中752份標(biāo)本EV71陽性，陽性檢出率為37.79％；452份CA16陽性，陽性檢出率為22.71％；1份EV71+CA16陽性，陽性檢出率為0.05％；91份其他EV陽性，陽性檢出率為4.57％。病原構(gòu)成結(jié)果顯示，HFMD病原以EV71為主，占陽性病例的58.03％(752/

4、1296)，次之是CA16，占陽性病例的34.88％(452/1296)，其他EV占一定比例，占陽性病例的7.02％(91/1296)。隨機(jī)抽取55份其他EV陽性標(biāo)本(42份普通病例、13份重癥病例)，進(jìn)一步分析上述其他EV中病原的構(gòu)成情況。經(jīng)RT-PCR和測序進(jìn)一步分型，除24份未定型外，共鑒定出31份，從構(gòu)成情況看，CA10占18.18％(10/55)，CA6占14.55％(8/55)，31份，從構(gòu)成情況看，CA10占18.18％(

5、10/55),CA6占14.55％(8/55)，ECO30占9.09％(5/55),ECO6、ECO9各占3.64％(2/55),CA5、CA14、CB5.ECO14各占1.82％(1/55)，未定型占43.64％(24/55)。結(jié)果提示，其他EV中病原構(gòu)成復(fù)雜，涉及多種病毒，本次試驗(yàn)共檢出9種，但主要以CA10、CA6、ECO30為主。
　　 2、從不同地區(qū)的病原構(gòu)成情況看，秦皇島、邯鄲、保定、邢臺地區(qū)EV71所占比例較高，分

6、別為77.53％、76.18％、69.12％、65.98％；衡水、滄州地區(qū)CA16所占比較高，分別為64.29％、51.28％；滄州地區(qū)其他EV所占比例相對較高，為33.33％。對55份其他EV陽性標(biāo)本進(jìn)一步分型顯示，除廊坊、邢臺、秦皇島未分出型別外，其他地區(qū)均存在一種或一種以上的其他型別。滄州地區(qū)11份標(biāo)本中，6份為CA10陽性，1份為ECO30陽性；石家莊地區(qū)其他EV型別種類較多，13份標(biāo)本中共檢出7種其他型別，分別為CA5、CA6

7、、CA10、CA14陽性各1份，ECO6、ECO9陽性各2份，ECO30陽性3份；邯鄲地區(qū)7份標(biāo)本中共檢出4種型別，分別為CA6、CA10、ECO30、ECO14陽性各1份。但仍有24份未分出型別。病原構(gòu)成顯示，滄州地區(qū)CA10所占比例較高，為54.55％(7/11)，石家莊地區(qū)ECO30所占比例較高，為23.08％(3/13)。
　　 3、不同疾病狀態(tài)病原構(gòu)成情況檢測普通病例1230例，陽性689例，陽性率56.02％，其中E

8、V71陽性260例，占37.74％；CA16陽性362例，占52.54％；其他EV67例，占9.72％，三者之比約為3.9:5.4:1。對42份其他EV進(jìn)一步分型顯示，CA10占19.05％(8/42),CA6占16.67％(7/42),ECO30占7.14％(3/42),ECO9占4.76％(2/42),CA5、CB5、CA14、ECO14各占2.88％(1/42)，未分型占42.86％(18/42)。檢測重癥病例747例，陽性594

9、例，陽性率79.52％，其中EV71+CA16陽性1例，占0.17％(1/594)；EV71陽性479例，占80.64％(479/594)；CA16陽性90例，占15.15％(90/594)；其他EV24例，占4.04％(24/594)，后三者之比約為20:3.8:1。對13例其他EV進(jìn)一步分型顯示，ECO6.ECO30、CA10各占15.38％(2/13),CA6占7.69％(1/13)，未分型占46.15％(6/13)。檢測死亡病例

10、13例，均為EV71陽性。
　　 4、共檢測糞便標(biāo)本141份，101份EV陽性，陽性率為71.63％；肛拭子標(biāo)本617份，514份EV陽性，陽性率為83.31％；皰疹液標(biāo)本90份，53份EV陽性，陽性率為58.89％；咽拭子標(biāo)本1141份，628份EV陽性，陽性率為55.04％；腦脊液1份，未檢出病毒核酸。
　　 5、將RT-PCR檢測為EV陽性的160份標(biāo)本接種RD細(xì)胞，進(jìn)行病毒分離，共分離到毒株57株，分離率為35.

11、63％。經(jīng)RT-PCR和測序鑒定，其中32株為EV71,9株為CA16,8株為CA16+EV71,6株為CA10,1株為CA6,1株為CA5。其中糞便標(biāo)本接種17份，分離9份，分離率為52.94％；肛拭子標(biāo)本接種42份，分離15份，分離率為35.71％；皰疹液標(biāo)本接種11份，分離3份，分離率為27.27％；咽拭子標(biāo)本接種89份，分離30份，分離率為33.71％；腦脊液標(biāo)本接種1份，未分離到病毒。
　　 6、18株EV71分離株之

12、間VP1區(qū)核苷酸同源性94.4％～99.8％，與全國10個省市分離株的VP1區(qū)核苷酸同源性在94.5％～99.6％之間，與A、B基因型代表株VP1區(qū)同源性差異較大，核苷酸同源性只在81.7％～82.7％、83.2％～85.1％之間，而與c基因型代表株比較接近，核苷酸同源性在86.6％～99.6％之間，與C1、C2、C3、C4、C5亞型代表株的VP1區(qū)核苷酸同源性分別在89％～90.1％、88.1％～90.2％、88％～89.2％、91.

13、9％～99.6％、86.6％～88.2％之間。
　　 7、9株CA16分離株間VP1區(qū)核苷酸同源性高達(dá)91.4％～99.9％，與A基因型代表株核苷酸同源性較低，為75.4％～77％，與33株B基因型代表株比較接近，核苷酸同源性在88.6％～99％之間。
　　 8EV71和CA16分離株基因分型及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，河北省EV71分離株為C4亞型的C4a進(jìn)化分支，CA16分離株屬于B基因型。
　　 9、16株EV7

14、1分離株在亞型相關(guān)表位的氨基酸組合模式為KADSTV，其余2株為KANSTV和KADSIV組合模式。
　　 1017株EV71分離株在VP1區(qū)抗原性表位高度保守，共同序列為EIDLPLEGTTNPNGYA，但2009-hebei-SJ2-120F第93位氨基酸由纈氨酸取代了異亮氨酸(Ⅰ-Ⅴ)。
　　 結(jié)論：
　　 1、2009年引起河北省手足口病流行的病原體主要為EV71和CA16，同時還有部分CA5.CA6、C

15、A10、CA14、CB5、ECO6、ECO9、ECO14、ECO30等其他型別，引起河北省重癥病例的EV主要型別為EV71。
　　 2、EV71.CA16毒株基因分型及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，河北省EV71分離株為C4亞型C4a進(jìn)化分支，CA16為B基因型。
　　 3、EV71分離株在6個亞型相關(guān)位點(diǎn)的主要氨基酸組合模式為KADSTv，還有KANSTV和KADSIV組合模式，為KADST1類似模式的補(bǔ)充模式。