阜陽地區(qū)2011~2012年手足口病流行病原譜及EV71基因型進化分析.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩59頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、目的:手足口病(hand,footand mouth disease,HFMD)是一種常見的兒童傳染病,其病原體型別眾多,除CA16和EV71外,還有其它腸道病毒。本研究采用從阜陽地區(qū)HFMD患兒標本中分離病毒的方法得到EV71、CA16分離株和其他腸道病毒分離株;利用分子生物學技術以其他腸道病毒的基因組為模板,擴增腸道病毒VP4基因序列,確定該毒株的型別:并對典型的分離株進行分子流行病學分析,了解其核苷酸及氨基酸變異情況,構建系統(tǒng)進化

2、樹;同時擴增EV71分離株的全基因組序列并測序,與國內外EV71毒株進行同源性比較和進化分析,了解阜陽地區(qū)HFMD流行病原譜和EV71分離株的分子流行病學特征,為手足口病的防治及疫苗研究工作提供參考。
  方法:本研究主要由四部分內容組成:(1)HFMD患兒咽拭子標本的病毒分離與鑒定:首先將采自臨床診斷為HFMD的患兒的133份咽拭子標本分別接種RD細胞和HEp-2細胞進行病毒分離。將分離得到的可疑病毒株利用透射電鏡進行形態(tài)學觀察

3、,同時用腸道病毒通用引物、EV71型特異性引物和CA16型特異性引物進行Real-timeRT-PCR檢測,以對分離物進行初步的型別鑒定;(2)非EV71非CA16腸道病毒株的鑒定及其VP4基因分型研究:對Real-timeRT-PCR檢測鑒定為腸道病毒,但又不是EV71和CA16的病毒株擴增其VP4基因序列并測序,測序結果與GenBank腸道病毒核苷酸序列經(jīng)BLAST比對確定其型別,并對其核苷酸序列進行同源性比較和進化分析;(3)對通

4、過VP4比對鑒定為脊髓灰質炎病毒(Polioviruses,PV)的毒株VP1基因片段進行PCR產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)分析,并擴增其VP1片段,將其插入至pMD18-Tsimple克隆載體,轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆,進行PCR鑒定及序列測定,并將序列與Sabin1標準株的VP1序列進行比對;(4)EV71地方流行株的全基因組序列擴增和測序:選取三株經(jīng)Real-timeRT-PCR檢測鑒定為EV71

5、的分離株進行中和實驗鑒定,擴增其全基因組序列,連接T載體后轉化到克隆載體中,提取質粒鑒定后并測序,將該核苷酸序列與國內外EV71毒株進行同源性比較和進化分析。
  結果:(1)本次研究中,從133例患兒標本中分離出疑似腸道病毒株52例,病毒分離陽性率為39.1%(52/133)。經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),在RD細胞胞漿中,可見直徑約30nm的球形無包膜腸道病毒樣顆粒;通過熒光PCR鑒定為EV71為11株,占陽性比例為21.2%;CA16

6、有5株,占陽性比例為9.6%;非EV71非CA16的其他腸道病毒36株,占陽性比例為69.2%。(2)成功擴增了36株非EV71非CA16其他腸道病毒的VP4片段,通過測序比對確定了34株的型別,病毒型別分布較為廣泛,既有柯薩奇A組病毒,也有柯薩奇B組病毒和脊髓灰質炎病毒(PV),幾組病毒伴隨同時流行,其中CA10所占的比例最高(52.8%),其次為CA4(13.9%);(3)對確定為PV的FY11039號毒株VP1基因進行PCR-RF

7、LP,分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)HaeⅢ、DdeⅠ內切酶作用后FY11039與標準株Sabin1的圖譜一致,提示它們屬于同一型,但經(jīng)HpaⅡ內切酶作用后,FY11039與標準株Sabin1的圖譜不一致,在對其VP1基因進行分析發(fā)現(xiàn)126位核苷酸存在突變,由G突變成A,而對其氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)序列并未發(fā)生變異;(4)對三株EV71分離株進行全基因組擴增,通過分析發(fā)現(xiàn),它們與EV71A型代表株BrCr的同源性較低(79.55%~79.64%);與C4亞

8、型的同源性較高(92.25%~99.60%)。
  結論:(1)基于VP4基因擴增和序列測定方法可以快速簡便的初步鑒別HEV的型別,在應對HEV引起的突發(fā)疫情病原學診斷方面具有重要的意義;(2)有些PV毒株的VP1核苷酸序列126位存在突變,HpaⅡ內切酶可能無法進行酶切,提示我們這種PCR-RFLP可能不再完全適用于對以后的PV分離株進行型內鑒定;(3)通過對EV71進行全基因組序列測定和分析,初步判斷2012年阜陽地區(qū)流行的E

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論