AMPA受體運(yùn)輸在杏仁外側(cè)核NMDA受體依賴性的突觸可塑性調(diào)節(jié)中的作用.pdf

1、學(xué)習(xí)與記憶是動(dòng)物和人賴以生存不可缺少的重要腦功能。學(xué)習(xí)是指獲得外界信息的過程，記憶是將獲得的信息儲(chǔ)存和讀出的神經(jīng)過程。眾多研究顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)之一。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性調(diào)節(jié)主要有兩種模式：長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)和長(zhǎng)時(shí)程減弱(LTD)。一般認(rèn)為，在研究較為徹底的海馬CA1部位，NMDA受體激活后導(dǎo)致的突觸后AMPA受體的運(yùn)輸(分泌與內(nèi)吞)是LTP和LTD誘導(dǎo)表達(dá)的主要機(jī)制。近期研究

2、發(fā)現(xiàn)LTP和LTD現(xiàn)象也存在于丘腦一杏仁外側(cè)核通路，被認(rèn)為對(duì)和恐懼情緒反應(yīng)有關(guān)的學(xué)習(xí)與記憶的突觸可塑性調(diào)節(jié)過程有重要作用。但其具體的內(nèi)在機(jī)制目前尚不清楚。因此本課題在杏仁核部位對(duì)作為腦內(nèi)突觸可塑性模式的LTP和LTD的神經(jīng)和細(xì)胞分子機(jī)制及其與學(xué)習(xí)記憶的相關(guān)性進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究。第一部分研究了不同模式電刺激丘腦一杏仁外側(cè)核傳入纖維通路所誘導(dǎo)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)和長(zhǎng)時(shí)程減弱(LTD)現(xiàn)象，并觀察了不同NMDA受體亞基在誘導(dǎo)中的作用；第二

3、部分研究了突觸后AMPA受體的運(yùn)輸是否參與杏仁外側(cè)核部位LTP和LTD的誘導(dǎo)表達(dá)。 一、NMDA受體在杏仁外側(cè)核突觸可塑性調(diào)節(jié)中的作用本部分研究中，用經(jīng)典的電刺激方法在大鼠腦薄片的丘腦-杏仁外側(cè)核傳入通路誘導(dǎo)LTP和LTD，在杏仁外側(cè)核區(qū)記錄興奮性突觸后電流EPSC。為了進(jìn)一步確定大鼠杏仁外側(cè)核區(qū)LTP/LTD與NMDA受體之間的關(guān)系，在電刺激誘導(dǎo)LTP/LTD前，用腦薄片灌流液內(nèi)給藥的方法進(jìn)行不同的競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑的預(yù)

4、處理，并觀察此種拮抗劑是否影響了LTP/LTD的誘導(dǎo)，以確定LTP/LTD誘導(dǎo)發(fā)生的受體依賴性過程。杏仁外側(cè)核(LA)直接接受來自丘腦和皮層的輸入，而杏仁核中的神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)主要發(fā)生在丘腦-LA通路，因此大量關(guān)于恐懼記憶形成的細(xì)胞和分子機(jī)制的研究都集中在這一環(huán)路上。在本實(shí)驗(yàn)中，高頻電刺激(HFS：串長(zhǎng)：100；頻率：100Hz；連續(xù)刺激3次，串間隔20s)和配對(duì)高頻電刺激丘腦-杏仁外側(cè)核傳入纖維通路，均能在杏仁外側(cè)核錐體神經(jīng)元誘導(dǎo)出穩(wěn)定

5、的LTP，主要表現(xiàn)為興奮性突觸后電流(EPSC)幅度的增加，并可穩(wěn)定的維持40-60分鐘以上。而低頻電刺激和配對(duì)低頻電刺激丘腦-杏仁外側(cè)核傳入纖維通路，則均能在杏仁外側(cè)核部位誘導(dǎo)出穩(wěn)定的LTD，主要表現(xiàn)為興奮性突觸后電流(EPSC)幅度的減小，并可穩(wěn)定的維持40-60分鐘以上。谷氨酸受體(GluR)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體。其中，NMDA受體在突觸可塑性調(diào)節(jié)中發(fā)揮的重要作用近年愈來愈被重視。本實(shí)驗(yàn)將NMDA受體抑制劑D-

6、APV(50uM)加入杏仁核腦薄片的灌流液，預(yù)處理20-30分鐘后以與對(duì)照組相同參數(shù)的電刺激分別誘導(dǎo)LTP和LTD，則LTP和LTD現(xiàn)象均不能被誘導(dǎo)發(fā)生；用NR2A亞基抑制劑NVP-AAM077(0.4uM)預(yù)處理腦薄片，則LTP的誘導(dǎo)被阻斷，LTD可正常發(fā)生；而用NR2B亞基抑制劑Ro25-6981(3uM)和Ifenprodil(10uM)預(yù)處理腦薄片，則LTP可被正常誘導(dǎo)，但LTD的誘導(dǎo)被阻斷。以上結(jié)果提示杏仁外側(cè)核部位的突觸可塑

7、性調(diào)節(jié)主要為NMDA受體依賴性的突觸過程，不同亞基組成的NMDA受體在決定大鼠杏仁核部位突觸可塑性的極性方面具有重要作用。 二、AMPA受體的運(yùn)輸參與杏仁外側(cè)核的突觸可塑性調(diào)節(jié)過程本部分實(shí)驗(yàn)采用腦片電生理方法觀察丘腦-杏仁外側(cè)核傳入通路上LTP誘導(dǎo)表達(dá)過程中與膜融合有關(guān)的囊泡內(nèi)受體分泌過程，以及AMPA受體的調(diào)節(jié)性內(nèi)吞過程與LTD之間的特異性聯(lián)系。并使用表面蛋白生物素分析方法(SurfaceBiotinylation Assay

8、)在杏仁外側(cè)核腦薄片上測(cè)定AMPA受體的細(xì)胞表面表達(dá)量，以觀察AMPA受體的運(yùn)輸是否參與杏仁外側(cè)核部位LTP和LTD的誘導(dǎo)表達(dá)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性突觸傳遞主要由谷氨酸受體：AMPA受體和NMDA受體介導(dǎo)。而突觸傳遞效率的改變主要取決于突觸前膜的神經(jīng)遞質(zhì)釋放量和聚集在突觸后膜的相應(yīng)受體數(shù)目。目前認(rèn)為對(duì)突觸后膜上的AMPA受體數(shù)目進(jìn)行調(diào)控是導(dǎo)致突觸可塑性發(fā)生的有效途徑。在突觸后部位利用神經(jīng)毒素TeTx(含200nM TeTx的細(xì)胞內(nèi)液充灌

9、記錄微電極)阻斷VAMP蛋白介導(dǎo)的囊泡受體的分泌過程，則LTP的表達(dá)被抑制；同樣，在突觸后部位利用干擾肽GluR23y(含100μg/mlGluR23Y的細(xì)胞內(nèi)液充灌記錄微電極)特異性阻斷AMPA受體的內(nèi)吞過程，則LTD的表達(dá)被阻斷。利用表面蛋白生物素分析、免疫沉淀和免疫印跡等方法測(cè)定在杏仁外側(cè)核部位有效誘導(dǎo)LTP或LTD前后，神經(jīng)元細(xì)胞表面上AMPA受體的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在高頻電刺激誘導(dǎo)LTP后，細(xì)胞膜表面的AMPA受體表達(dá)增加，主要表現(xiàn)為

10、GluRl亞單位表達(dá)明顯增多；低頻電刺激誘導(dǎo)LTD后，細(xì)胞膜表面的AMPA受體表達(dá)減少，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜表面GluR2亞單位的表達(dá)顯著減少。細(xì)胞膜上AMPA受體的數(shù)量在誘導(dǎo)LTP/LTD后短時(shí)間內(nèi)發(fā)生了顯著性變化。提示誘導(dǎo)LTP后可以促進(jìn)AMPA受體由胞內(nèi)遷移至細(xì)胞膜表面(插膜)，而誘導(dǎo)LTD后則可以促進(jìn)AMPA受體從細(xì)胞膜表面移入到胞內(nèi)(內(nèi)化)。 本研究證實(shí)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)和長(zhǎng)時(shí)程減弱(LTD)現(xiàn)象存在于丘腦-杏仁外側(cè)核通

11、路，它們的誘導(dǎo)發(fā)生均需要NMDA受體的參與。含有NR2A亞基的NMDA受體的激活導(dǎo)致LTP的形成，含有NR2B亞基的NMDA受體的激活導(dǎo)致LTD的形成，說明不同亞基組成的NMDA受體在決定大鼠杏仁核部位突觸可塑性的極性方面具有重要作用。而杏仁外側(cè)核部位這種NMDA受體依賴性的突觸可塑性調(diào)節(jié)過程需要AMPA受體運(yùn)輸?shù)膮⑴c。膜融合依賴性的AMPA受體分泌過程參與LTP的誘導(dǎo)表達(dá)，有效誘導(dǎo)LTP后伴隨神經(jīng)元細(xì)胞表面AMPA受體的表達(dá)增加；而A