α CaMKⅡ在小鼠杏仁核突觸可塑性及靈活性學(xué)習(xí)中的作用.pdf

1、大量的研究證明,鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在學(xué)習(xí)與記憶和突觸可塑性中發(fā)揮著重要的作用。2003年Tsien帶領(lǐng)的科研小組成功創(chuàng)建出蛋白修飾的αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因小鼠。該轉(zhuǎn)基因模式小鼠有許多優(yōu)點(diǎn):1)區(qū)域特異性,使用αCaMKⅡ啟動(dòng)子,實(shí)現(xiàn)了αCaMKⅡ在前腦皮層、海馬和杏仁核等區(qū)域特異性過量表達(dá)。2)分子特異性,根據(jù)蛋白工程原理設(shè)計(jì)篩選出與過量表達(dá)的αCaMKⅡ-F89G是“鎖和鑰匙”關(guān)系的特異性抑制物(NM-P

2、P1),NM-PP1能夠特異性地與外源αCaMKⅡ-F89G結(jié)合并抑制該酶的活性。3)激酶活性的實(shí)時(shí)可控性,利用腹腔注射小分子抑制物的方法(NM-PP1,16.6ng/g,小鼠體重),可在幾分鐘內(nèi)抑制外源αCaMKⅡ-F89G的活性。而小鼠長期口服小分子抑制物(5μM,飲用水)無明顯副作用,效果顯著,抑制物去除后,蛋白激酶可恢復(fù)活性。實(shí)現(xiàn)了在整體動(dòng)物上,對(duì)αCaMKⅡ激酶進(jìn)行可逆性(reversible)和誘導(dǎo)性(induceble)的

3、實(shí)時(shí)調(diào)控(分鐘級(jí))。以往的研究多集中于αCaMKⅡ在一種固定規(guī)則學(xué)習(xí)任務(wù)中的作用,但是αCaMKⅡ在非固定規(guī)則學(xué)習(xí)任務(wù)即靈活性學(xué)習(xí)中的作用卻少有研究。靈活性學(xué)習(xí)在動(dòng)物適應(yīng)多變的環(huán)境從而得以生存方面起著重要的作用。已有研究表明靈活性學(xué)習(xí)主要和LTD有關(guān)。另有研究證實(shí)LTD的誘導(dǎo)和αCaMKⅡ密切相關(guān)。前腦過量表達(dá)αCaMKⅡ?qū)τ谛尤屎送挥|可塑性及杏仁核相關(guān)的靈活性學(xué)習(xí)是否產(chǎn)生影響?與其相關(guān)的分子與細(xì)胞機(jī)制是什么?為了解答這些問題,本研究利

4、用蛋白修飾αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因小鼠,將離體腦片電生理技術(shù)、整體行為學(xué)和形態(tài)學(xué)方法相結(jié)合。重點(diǎn)研究了前腦過量表達(dá)的αCaMKⅡ?qū)η鹉X——杏仁核LA區(qū)(T-LA)通路的NMDA受體依賴性的長時(shí)程減弱(Long-term Depression,LTD)、長時(shí)程增強(qiáng)(Long-term Potentiation,LTP)、杏仁核和海馬相關(guān)的再學(xué)習(xí)及情緒行為的影響。本課題研究主要包括以下五個(gè)部分:1αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因小鼠杏仁核腦

5、區(qū)突觸可塑性的研究1.1基本突觸傳遞分析采用離體腦片場電位記錄技術(shù),考察了前腦特異性過量表達(dá)αCaMKⅡ?qū)D(zhuǎn)基因模式小鼠丘腦傳入纖維投射到杏仁核(T-LA)通路的基本突觸傳遞功能影響。分析比較了αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩對(duì)照小鼠的興奮性突觸后電位的刺激強(qiáng)度-反應(yīng)關(guān)系(Input-Output curve)和雙脈沖抑制反應(yīng)(Paired pulsedepression,PPD)。結(jié)果顯示αCaMKⅡ轉(zhuǎn)基因小鼠杏仁核Input-

6、Output和PPD曲線與同窩對(duì)照組相比無顯著性差異。提示了αCaMKⅡ在前腦的過量表達(dá)不改變轉(zhuǎn)基因模式小鼠突觸后AMPA受體的功能和突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放的功能。1.2不同頻率的刺激對(duì)杏仁核突觸可塑性分析采用離體腦片場電位記錄技術(shù),研究了αCaMKⅡ在前腦特異性過量表達(dá)對(duì)小鼠丘腦傳入纖維投射到杏仁核LA區(qū)(T-LA)通路的突觸可塑性的影響。結(jié)果顯示,與同窩對(duì)照小鼠相比,低頻刺激(1Hz,15min和3Hz,5min)在αCaMKⅡ-F89

7、G轉(zhuǎn)基因小鼠上都不能誘導(dǎo)出顯著的LTD現(xiàn)象。而在相同的刺激條件下,在人工腦脊液中加入αCaMKⅡ-F89G特異性拮抗劑NM-PP1(0.5μM)能補(bǔ)償αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠杏仁核LTD缺陷。當(dāng)NM-PP1和NMDA受體拮抗劑APV(50μM)同時(shí)加入時(shí),也能夠抑制αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠和同窩對(duì)照鼠杏仁核LTD。使用中頻刺激(10Hz,1.5min)后,αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠杏仁核的突觸反應(yīng)無顯著的變化。最后分別采

8、用Theta burst刺激和高頻強(qiáng)直刺激方法,在兩組腦片上都能夠誘導(dǎo)出穩(wěn)定的LTP,兩組之間無顯著性差異。由此認(rèn)為,αCaMKⅡ參與了杏仁核腦區(qū)NMDAR依賴性的LTD的形成,αCaMKⅡ前腦的過量表達(dá)可以引起NMDAR依賴的LTD的缺陷。但前腦過量表達(dá)αCaMKⅡ?qū)D(zhuǎn)基因組杏仁核LTP現(xiàn)象無顯著影響。總之,αCaMKⅡ在前腦特異性過量表達(dá)對(duì)小鼠T-LA通路的突觸可塑性頻率反應(yīng)曲線產(chǎn)生顯著性影響。結(jié)果表明,前腦特異性過量表達(dá)αCaMK

9、Ⅱ抑制T-LA突觸的NMDA受體依賴性的LTD,而不影響LTP的誘導(dǎo)。2αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因模式小鼠靈活性學(xué)習(xí)能力研究盡管CaMKⅡ在學(xué)習(xí)與記憶中的作用已經(jīng)有不少的研究報(bào)道,但CaMKⅡ在靈活性學(xué)習(xí)中的作用卻少有研究。為了研究αCaMKⅡ在前腦過量表達(dá)對(duì)小鼠的靈活性學(xué)習(xí)能力的影響,選用3月齡αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠和同窩對(duì)照野生型鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、條件恐懼記憶消退實(shí)驗(yàn)(Fear extinction)和條件味覺

10、厭惡記憶消退實(shí)驗(yàn)(Extinction of conditioned taste aversion)。結(jié)果顯示,(1)在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的可視平臺(tái)測試中,αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠的視覺和求生的動(dòng)機(jī)表現(xiàn)正常;在定位航行訓(xùn)練和第一次空間探索測試中,兩組鼠在逃避潛伏期及目標(biāo)象限探索時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;但是在反向定位空間學(xué)習(xí)階段,轉(zhuǎn)基因組在第二、三天逃避潛伏期和游泳距離明顯長于同窩對(duì)照組。(2)條件恐懼記憶消退實(shí)驗(yàn)中,在測試階段第三、

11、四、五天,轉(zhuǎn)基因組對(duì)條件刺激(聲音和場景)產(chǎn)生驚嚇反應(yīng)程度顯著高于同窩組照組;當(dāng)αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠在整個(gè)消退測試階段接受特異性拮抗劑NM-PP1時(shí),其驚嚇反應(yīng)程度對(duì)照組相比無顯著性差異。(3)條件味覺厭惡記憶消退實(shí)驗(yàn)中,在測試階段的第二、三天,轉(zhuǎn)基因組對(duì)糖精鈉溶液的厭惡指數(shù)顯著高于對(duì)照組;而在消退測試階段中,當(dāng)αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠飲用含有NM-PP1的水和糖精鈉溶液時(shí),αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠對(duì)糖精鈉溶液厭惡

12、程度與對(duì)照組相當(dāng)。在自然狀態(tài)下,αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠和同窩對(duì)照鼠對(duì)糖精鈉溶液的偏好程度和對(duì)奎寧溶液的厭惡程度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明,前腦特異性過量表達(dá)αCaMKⅡ降低αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠靈活性學(xué)習(xí)能力。3αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因模式小鼠厭惡性動(dòng)機(jī)學(xué)習(xí)能力研究已有研究證明前腦特異性過量表達(dá)αCaMKⅡ損傷αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠條件恐懼記憶(Fear conditioning memory)和新異物體識(shí)別記憶

13、(Novel objectrecognition memory)。但前腦過量表達(dá)αCaMKⅡ?qū)τ谄渌愋蛥拹盒詣?dòng)機(jī)學(xué)習(xí)與記憶影響未有報(bào)道,我們利用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)和條件味覺厭惡實(shí)驗(yàn)檢測不同感覺為基礎(chǔ)的厭惡性記憶。結(jié)果顯示,在跳臺(tái)和被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)測試中,αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠潛伏期顯著短于同窩對(duì)照組;在條件味覺厭惡實(shí)驗(yàn)測試中,該轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)糖精鈉溶液厭惡程度顯著低于同窩對(duì)照組。但在厭惡性記憶檢測前15min腹腔注射NM-PP1

14、后,αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠表現(xiàn)正常。實(shí)驗(yàn)表明前腦過量表達(dá)αCaMKⅡ?qū)p傷αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠的厭惡性動(dòng)機(jī)記憶。提示前腦αCaMKⅡ在厭惡性動(dòng)機(jī)記憶提取階段發(fā)揮著重要的作用。4αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因模式小鼠基本運(yùn)動(dòng)能力及情緒行為的研究為了進(jìn)一步驗(yàn)證αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因小鼠的靈活性學(xué)習(xí)及厭惡性學(xué)習(xí)能力降低是否由于αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因小鼠的基本活動(dòng)量和情緒行為異常造成的。我們選用開場、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、高架十

15、字迷宮、強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測試。結(jié)果顯示,在開場和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)測試中,αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因小鼠的基本活動(dòng)量、探究行為、體力和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力與同窩對(duì)照組相比無顯著性差異。高架十字迷宮、強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)中,αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因小鼠在焦慮及抑郁等情緒方面表現(xiàn)正常。由此認(rèn)為,αCaMKⅡ在前腦過量表達(dá)不影響轉(zhuǎn)基因小鼠的基本活動(dòng)量及情緒行為。證實(shí)了αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因小鼠在靈活性學(xué)習(xí)和厭惡性學(xué)習(xí)任務(wù)中的行為缺陷是由其學(xué)習(xí)記

16、憶能力下降導(dǎo)致的。5αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因模式小鼠前腦形態(tài)學(xué)研究用尼氏染色技術(shù)顯示3-4月齡αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠和野生對(duì)照鼠前腦海馬、杏仁核和島葉的形態(tài),并進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示,與對(duì)照鼠相比,αCaMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠海馬、島葉及杏仁核等形態(tài)結(jié)構(gòu)顯示正常。提示前腦特異性過量表達(dá)αCaMKⅡ不改變?chǔ)罜aMKⅡ-F89G轉(zhuǎn)基因鼠前腦海馬、杏仁核和島葉皮層的形態(tài)結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果提示,αCaMKⅡ在前腦過量表達(dá)對(duì)αCaMKⅡ