本氏煙NbRDR1m天然突變體原型NbRDR1在病毒防御中的功能研究.pdf

1、植物體內(nèi)依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RDRs)可介導(dǎo)RNA沉默信號的放大，在植物病毒防御反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。與煙草屬中其他種類的相比，本氏煙（Nicotiana benthamiana）對病毒侵染表現(xiàn)出超敏感，通常會表現(xiàn)出更為嚴重的病毒癥狀。有研究表明本氏煙NbRDR1m(Nicotiana benthamiana RNA dependent RNA polymerase1

2、mutant)編碼區(qū)的開放閱讀框架內(nèi)有一段72個堿基的插入片段，該插入片段造成開放閱讀框架的提前終止而不能得到全長且有功能的NbRDR1蛋白可能是造成其對病毒侵染超敏感的主要原因。但該猜測并未得到證實。為了確證這一猜測，我們首先通過融合PCR技術(shù)去除NbRDR1m中72個插入堿基，將NbRDR1m恢復(fù)至NbRDR1的原型。然后將該原型NbRDR1構(gòu)建雙元載體并轉(zhuǎn)化至野生型本氏煙中創(chuàng)制過表達NbRDR1的轉(zhuǎn)基因株系。通過抗生素篩選和基因組

3、PCR，鑒定出轉(zhuǎn)基因株系并采用半定量RT-PCR分析各轉(zhuǎn)基因株系NbRDR1的表達情況。隨機挑選2個表達量較高和一個表達量較低的轉(zhuǎn)基因株系用與GFP融合的煙草屬病毒煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV-GFP），及非煙草屬病毒蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV-GFP）和馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX-GFP)進行病毒侵染實驗，比較其與野生型及空載體對照株對這三種