HIF-1α突變體對(duì)缺血心肌血管生成及心功能影響的研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是近年來(lái)發(fā)達(dá)國(guó)家主要的死亡原因之一，在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率和死亡率也呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)?？鼓?、抗血小板聚集、調(diào)脂、穩(wěn)定斑塊是近年來(lái)針對(duì)缺血性心臟病的常規(guī)藥物治療措施，經(jīng)皮介入血管重建術(shù)發(fā)展迅速和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)也是近年來(lái)的重要治療手段，但同時(shí)都存在支架內(nèi)及移植血管再狹窄、部分患者因病變彌漫不適合介入治療的等問(wèn)題，影響患者預(yù)后。
　　在因血管狹窄或阻塞等病變導(dǎo)致組織器官缺血時(shí),機(jī)體內(nèi)

2、相關(guān)促血管新生因子被激發(fā)而表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)缺血局部側(cè)支循環(huán)的形成，但自身的這種代償作用往往不完全或不及時(shí)。治療性血管生成，通過(guò)外源性補(bǔ)充促血管生成因子（重組蛋白或基因）直接促進(jìn)新生血管的生成，從而改善缺血組織的血液供應(yīng)。近年來(lái)在缺血性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究中所開(kāi)展的治療性血管新生主要是基因治療和蛋白質(zhì)治療，二者對(duì)比，蛋白質(zhì)治療所需劑量大，效用維持時(shí)間短，一般需要反復(fù)使用，目前已很少被應(yīng)用?；蛑委熆稍诰植砍掷m(xù)表達(dá)起作用，有可能僅需單次治療就能達(dá)到

3、預(yù)期的治療效果。故而以基因轉(zhuǎn)染技術(shù)來(lái)促進(jìn)血管新生成為目前的研究重點(diǎn)。
　　隨著對(duì)血管生成機(jī)制的逐步研究,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)了許多有促進(jìn)血管生成能力的因子。最早被用于動(dòng)物與臨床研究的為VEGF（Vascular endothelial growth factor）與FGF（Fibroblast growth factor）。VEGF和FGF通過(guò)了I期臨床試驗(yàn)，但I(xiàn)I期臨床試驗(yàn)的結(jié)果卻不容樂(lè)觀(guān)[1]，發(fā)現(xiàn)VEGF可引起不成熟血管的生成、血管滲

4、透性變大、組織水腫出現(xiàn)[2]，F(xiàn)GF在促進(jìn)新生血管形成的同時(shí),部分實(shí)驗(yàn)患者出現(xiàn)了明顯的蛋白尿。故而需要尋找新的促血管生成因子。
　　血管新生是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，需要多種因子共同參與，依靠單一的促血管新生因子很難順利完成。近年研究顯示：HIF-1是一個(gè)非常重要的核轉(zhuǎn)錄因子，能直接或間接調(diào)控100多種下游靶基因[3，4]，這些下游靶基因在血管生長(zhǎng)、血管張力、紅細(xì)胞生成、糖代謝、干細(xì)胞誘導(dǎo)分化等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[5]。HIF-1是由

5、α和β兩個(gè)亞基組成的異二聚體[6]，以異源性二聚體的結(jié)構(gòu)形式存在。HIF-1α是專(zhuān)一受O2調(diào)節(jié)的HIF-1亞單位，決定HIF-1的活性。在血管生成基因治療領(lǐng)域，研究的重點(diǎn)是HIF-1α。到目前為止，已查明經(jīng) HIF-1α直接調(diào)控參與血管新生的基因有30多種，是血管新生的上游核心調(diào)控因子[7-10]。
　　HIF-1α結(jié)構(gòu)域中含有氧依賴(lài)降解區(qū)(Oxygen Dependent Degradation Domain, ODDD)，OD

6、DD區(qū)Pro402以及Pro564的兩個(gè)脯氨酸殘基是否羥基化決定其蛋白穩(wěn)定性[11]。HIF-1αC末端含有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(C-Transactivation Domains,C-TAD)。C-TAD的Asn803是否被羥基化決定其蛋白轉(zhuǎn)錄活性[12]。常氧情況下，Pro402、Pro564和Asn803被羥化后，HIF-1α不穩(wěn)定，在3-5分鐘內(nèi)被迅速降解，轉(zhuǎn)錄活性下降。低氧時(shí)，該過(guò)程受到抑制[13，14]。
　　因此對(duì)ODD

7、D區(qū)的402，564位點(diǎn)和TAD區(qū)的803位點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合突變，理論上可以最大程度地提高HIF-1α的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，從而達(dá)到滿(mǎn)意的促血管生成作用的效果。我們的前期離體研究表明將HIF-1α關(guān)鍵功能區(qū)ODDD的Pro402、Pro564兩個(gè)位點(diǎn)及TAD的Asn803聯(lián)合突變構(gòu)建的Ad-HIF-1α-Trip在常氧下能穩(wěn)定存在，從而進(jìn)一步促進(jìn)對(duì)下游促血管生成因子的調(diào)控。
　　本研究建立大鼠急性心肌梗死模型，采用肌肉注射的方式將以腺病毒

8、為載體的HIF-1α突變體Ad-HIF-1α-Trip轉(zhuǎn)染于大鼠缺血心肌局部，研究Ad-HIF-1α-Trip對(duì)大鼠缺血心肌的促血管生成作用及部分安全性。
　　研究方法：
　　1.構(gòu)建Ad-HIF-1α-402/564、Ad-HIF-1α-Trip，Ad-HIF-1α-402/564、Ad-HIF-1α-Trip在 HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增，氯化銫密度梯度離心、透析純化后滴度達(dá)到1.0×1011PFU/ml(本課題組先期構(gòu)建)

9、。
　　2.建立急性大鼠心肌梗死模型150只,隨機(jī)分成5組:Saline組、Ad-Null組、Ad-HIF-1α-402/564組、Ad-HIF-1α-Trip組、VEGF組，在缺血心肌通過(guò)肌肉注射方式進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染?；蜣D(zhuǎn)染后7天、14天、21天，28天對(duì)大鼠行心臟彩超檢查評(píng)價(jià)心功能，取大鼠心臟行病理切片、免疫組化CD31染色，觀(guān)察血管新生情況;基因轉(zhuǎn)染后28天處死大鼠，取心臟，行TTC染色檢查，評(píng)估梗死面積。
　　3.基因

10、轉(zhuǎn)染后1周抽取靜脈血測(cè)定心肌酶、肌鈣蛋白I、肝功能、腎功能、血常規(guī)。
　　4.應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　研究結(jié)果：
　　1.超聲結(jié)果顯示:基因轉(zhuǎn)染后7天，LVEF、LVFS均表現(xiàn)為Ad-HIF-1α-Trip組＞VEGF/Ad-HIF-1α-402/564＞Saline組/Ad-Null組，隨時(shí)間延長(zhǎng)，各組指標(biāo)均呈現(xiàn)隨時(shí)間而下降的趨勢(shì)，但Ad-HIF-1α-Trip組相對(duì)穩(wěn)定，提示Ad-HIF-1

11、α-Trip對(duì)心功能有保護(hù)作用，其它各組心功能均有不同程度的降低。
　　2.基因轉(zhuǎn)染后7天轉(zhuǎn)染部位心肌組織免疫組化可見(jiàn)，CD31陽(yáng)性細(xì)胞被染成棕黃色或棕色，散布于心肌梗死區(qū)及心肌梗死周邊區(qū)，Ad-HIF-1α-Trip組表現(xiàn)最為明顯。進(jìn)行微血管密度計(jì)數(shù)（Microvessel density, MVD）計(jì)數(shù)，由高到低依次為：Ad-HIF-1α-Trip＞VEGF組/Ad-HIF-1α-402/564＞Ad-Null組＞Saline

12、組，One way ANOVA分析結(jié)果顯示：組間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩對(duì)比結(jié)果顯Ad-Null組與Saline組間，VEGF組與Ad-HIF-1α-402/564組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），余兩兩對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P＜0.05）。基因轉(zhuǎn)染后14天，Ad-HIF-1α-Trip組、VEGF組、Ad-HIF-1α-402/564組MVD明顯減少，但仍多于Ad-Null組及Saline組，至基因轉(zhuǎn)染后28

13、天，5組MVD大致在同一水平。
　　3.大鼠急性心肌梗死模型基因轉(zhuǎn)染后7天，大鼠血常規(guī)和生化指標(biāo)比較結(jié)果顯示：各組大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)均表現(xiàn)為略有增高，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），RBC、RBC、PLT、Hb、MCV、MCH計(jì)數(shù)均在正常范圍，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），cTnI、CK、CK-MB濃度均高于正常值，由低至高均表現(xiàn)為Ad-HIF-1α-Trip組＜VEGF組/Ad-HIF-1α-402/564組＜Ad-

14、Null組/Saline組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肝腎功能指標(biāo)未見(jiàn)明顯異常。
　　4.HE染色結(jié)果顯示：術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)，心、肝、腎、肺、脾、睪丸HE染色光鏡下觀(guān)察未見(jiàn)明顯病理組織學(xué)改變。
　　5.TTC染色結(jié)果示：術(shù)后28天，用TTC染色方法檢測(cè)各組大鼠心肌梗死面積。Ad-Null組/Saline組＞VEGF組/Ad-HIF-1α-402/564組＞Ad-HIF-1α-Trip組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研