新的乙型肝炎病毒X基因突變體的發(fā)現(xiàn)及其功能研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的持續(xù)感染與慢性肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。乙肝病毒X開放讀碼框編碼的X蛋白（HBx）在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，但其致癌的分子機(jī)制目前尚不十分清楚。為了進(jìn)一步闡明HBx與肝癌發(fā)病的關(guān)系，我們檢測(cè)了慢性肝病患者血清中乙肝病毒X抗原（HBxAg）和抗HBx抗體（anti-HBx）；應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)慢性肝病患者血清中乙肝病毒X基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了新的HBV x基因突變體，在此基礎(chǔ)上

2、對(duì)新的HBV X基因突變體的功能進(jìn)行了研究。主要研究內(nèi)容如下：
　　 第一部分，兔抗人HBx蛋白多克隆抗體的制備
　　 為了闡明慢性肝病患者血清中HBxAg和anti-HBx的臨床意義，制備了兔抗人HBx蛋白多克隆抗體。實(shí)驗(yàn)中，首先應(yīng)用PCR技術(shù)，獲得HBx基因片斷，然后將其克隆至pET-30a原核表達(dá)載體中，將其命名為pET-30a-X。將pET-30a-X質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，經(jīng)異丙基-β-D-硫代

3、半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)，大量表達(dá)His-HBx融合蛋白；利用Ni-NTA磁珠對(duì)His-HBx融合蛋白進(jìn)行純化；純化后將重組蛋白免疫家兔，制備兔抗HBx多克隆抗體，并對(duì)該抗體進(jìn)行純化。
　　 第二部分，慢性肝病患者血清中HBxAg和anti-HBx的測(cè)定及其臨床意義
　　 為了闡明慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者血清中HBxAg和anti-HBx的臨床意義，我們應(yīng)用純化的兔抗HBx多克隆抗體和重組蛋白，建立酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

4、（ELISA）技術(shù)，分別對(duì)173例慢性乙型肝炎（CHB）、106例肝硬化（LC）和61例肝癌（HCC）患者及213例正常人血清中的HBxAg和anti-HBx進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，HBxAg/anti-HBx在CHB、LC和HCC患者血清中的陽性率分別為8.7％/10.4％、17.9％/14.6％和9.8％/34.4％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，與CHB組相比，LC或HCC患者血清中anti-HBx的陽性率較高（P<0.01）。結(jié)合臨床病歷中

5、記錄的其他HBV血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)在血清anti-HBs陽性病例中，anti-HBx的陽性檢出率為5.2％（1/19）；而在HBsAg、HBeAg和anti-HBc三項(xiàng)同時(shí)為陽性的病例中，anti-HBx的陽性檢出率為28.9％（39/135），二者相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)照組213名正常人血清中HBxAg和anti-HBx均為陰性。本研究結(jié)果提示，血清中anti-HBx并非一個(gè)保護(hù)性抗體，而是H

6、BV感染和復(fù)制的標(biāo)志，是從CHB向LC或HCC發(fā)展的重要標(biāo)志之一。
　　 第三部分，新的乙肝病毒x基因突變體的發(fā)現(xiàn)
　　 HBV感染后患者血清中病毒DNA發(fā)生突變與HBV的致病作用密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用PCR方法對(duì)42例CHB、94例LC和52例HCC患者血清中HBx基因進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，檢測(cè)HBx基因的突變情況。結(jié)果顯示，在1例CHB和2例LC患者血清中檢測(cè)出一個(gè)未見報(bào)道的新的HBx基因突變位點(diǎn)。

7、3例位點(diǎn)均在HBx基因的第382-401個(gè)堿基發(fā)生了缺失突變，導(dǎo)致新的終止密碼子TAG產(chǎn)生，致使X蛋白從第127個(gè)氨基酸起羧基末端表達(dá)缺失。
　　 第四部分：突變型HBx蛋白功能變化的研究
　　 為了進(jìn)一步詳細(xì)闡明該HBx基因突變體發(fā)生的分子病毒學(xué)意義，我們將來源于血清中發(fā)生突變的HBx基因構(gòu)建于真核表達(dá)載體pCDNA3中，命名為pCDNA3-X-Sera。此外，人為將野生型HBx基因的C末端編碼27個(gè)氨基酸的81個(gè)堿基

8、進(jìn)行缺失突變，將其克隆在真核表達(dá)載體pCDNA3中，命名為pCDNA3-X△127。為進(jìn)一步研究該突變體的功能變化奠定基礎(chǔ)。從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究：
　　 第一，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用：將pCDNA3-X-Sera、pCDNA3-X△127質(zhì)粒和克隆有野生型HBx基因的真核表達(dá)載體（pCMV-X）分別進(jìn)行瞬時(shí)基因轉(zhuǎn)染，導(dǎo)入人正常人L-O2肝細(xì)胞系中，通過流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果顯示，野生型HBx基因具有促細(xì)胞凋亡的作用，而兩個(gè)突變型H

9、Bx基因的上述功能消失。
　　 第二，介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用：實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將pCMV-X質(zhì)粒和克隆有3’端缺失突變型HBx基因的pCDNA3-X-Sera、pCDNA3-X△127質(zhì)粒分別導(dǎo)入培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞系L-O2中，經(jīng)G-418篩選，獲得了穩(wěn)定表達(dá)HBx蛋白的肝細(xì)胞系，分別命名為L-O2-X、L-O2-X-Sera和L-O2-X△127。然后，對(duì)L-O2-X、L-O2-X-Sera和L-O2-X△127細(xì)胞進(jìn)行了

10、生物學(xué)特性鑒定，從細(xì)胞形態(tài)、染色體核型、細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞周期、克隆形成率和癌蛋白表達(dá)等方面進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與L-O2-X細(xì)胞相比，L-O2-X-Sera和L-O2-X△127細(xì)胞在染色體核型分析方面，表現(xiàn)出更為明顯的染色體丟失或異倍體；在細(xì)胞增殖方面，增殖能力明顯增強(qiáng)；在克隆形成率方面，具有較高的能力：c-Myc、PCNA和cyclinD1的表達(dá)水平明顯增加。初步結(jié)果提示，新發(fā)現(xiàn)的HBx基因突變體具有更強(qiáng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。
　　

11、 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)血清中anti-HBx是慢性肝病患者從CHB向LC和（或）HCC發(fā)展的重要血清學(xué)標(biāo)志之一；從慢性肝病患者血清中發(fā)現(xiàn)了新的HBx基因突變體，導(dǎo)致HBx蛋白羧基末端的27個(gè)氨基酸表達(dá)缺失；與野生型HBx基因相比，該HBx基因突變體的促細(xì)胞凋亡功能消失，但其細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力明顯增強(qiáng)，對(duì)發(fā)揮其致癌作用具有重要意義。上述研究為揭示HBx基因和HBx蛋白致癌的分子機(jī)制提供了新的重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)肝癌的早期診斷、預(yù)防和治療具有重要