谷胱甘肽與銅綠假單胞菌致病性及抗生素抗性的關(guān)系研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是病人在醫(yī)院發(fā)生感染的第三大條件致病菌，對(duì)宿主細(xì)胞引起的氧化傷害，是其導(dǎo)致病人感染死亡的原因之一。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化劑之一，其含量變化與疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系。資料顯示許多肺部疾病如囊腫性纖維化(cysticfibrosis，CF)病人的呼吸道上皮分泌液(epithelial lining fluid，ELF)中，GSH的水平異常

2、低下。由銅綠假單胞菌感染引起的氧化傷害也是導(dǎo)致CF病人癥候出現(xiàn)的主要原因之一。因此，在臨床實(shí)驗(yàn)中已有用吸入GSH的方法來提高CF病人ELF中的GSH水平。另據(jù)資料顯示，GSH一方面可以減輕抗生素作用細(xì)菌時(shí)對(duì)宿主細(xì)胞造成的氧化損害，一方面又消除了一些抗生素所引起的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)氧化壓力，保護(hù)細(xì)菌抵御抗生素的抑殺，降低細(xì)菌對(duì)一些抗生素的敏感性。為了了解GSH在細(xì)胞中這種功能上的矛盾，以及和銅綠假單胞菌之間的關(guān)系，研究了GSH和銅綠假單胞菌致病性

3、的關(guān)系及對(duì)不同抗生素敏感性的影響。 為了研究GSH與銅綠假單胞菌致病性的關(guān)系，以熒光素酶基因操縱子lux CDABE發(fā)光報(bào)道基因構(gòu)建的致病性因子啟動(dòng)子庫為平臺(tái)，外加不同濃度GSH或化學(xué)試劑耗竭細(xì)胞內(nèi)GSH，對(duì)啟動(dòng)子庫進(jìn)行篩選比較，依據(jù)luxCDABE報(bào)道子發(fā)光值的變化情況，尋找與GSH有關(guān)的致病性因子；構(gòu)建銅綠假單胞菌谷胱甘肽合成酶基因突變體PAOl(AgshB)和谷胱甘肽還原酶突變體PAOl(△gor)，在分子水平進(jìn)一步確認(rèn)G

4、SH和這些致病性因子的關(guān)系，分析GSH對(duì)銅綠假單胞菌致病性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSH對(duì)啟動(dòng)子庫中exoS、exoY、phzAl和gacA等致病性因子的表達(dá)有促進(jìn)作用，對(duì)其余測(cè)試過的致病性因子則沒有明顯影響；銅綠假單胞菌分泌的重要致病因子綠膿菌素( pyocyanin，PCN)的含量，在PAOl(△gshB)中遠(yuǎn)低于PA01(P＜0.01)；加入GSH后，PCN平均含量在PAOl(△gshB)中從0.47μg/mL提高到1.73μg/mL，

5、差異十分顯著(P＜0.01)，在PAO1中從1.3μg/mL提高到1.9μg/mL，差異顯著(P＜0.05)，表明GSH對(duì)銅綠假單胞菌生產(chǎn)PCN有促進(jìn)作用。由于exoS、exoY． phzAl、gacA和PCN與群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum—sensing，QS)有著密切的關(guān)系，我們對(duì)GSH和QS系統(tǒng)的關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，QS系統(tǒng)中rhl系統(tǒng)對(duì)gshB和gor基因有負(fù)調(diào)節(jié)作用。除了對(duì)以上致病性因子產(chǎn)生影響外，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌外排

6、泵MexXY—OprM的表達(dá)在PAO1(△gshB)中顯著降低，并通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)是由gshB基因的突變引起的，說明GSH對(duì)MexXY—OprM的表達(dá)有促進(jìn)作用。 為了研究GSH對(duì)抗生素抗菌活性的影響，利用瓊脂擴(kuò)散方法和最低抑菌濃度(MIC)方法，研究了GSH的存在引起的銅綠假單胞菌對(duì)不同抗生素敏感性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在LB液體中添加3μg/μL的GSH，銅綠假單胞菌對(duì)卡那霉素、紅霉素、頭孢噻肟鈉、環(huán)丙沙星、羧芐青霉素和硫酸鏈霉

7、素的敏感性降低，而對(duì)四環(huán)素的敏感性增加。銅綠假單胞菌對(duì)卡那霉素的MIC由240μg/mL增加為1600μg/mL，對(duì)四環(huán)素的MIC由25μg/mL降為1.25μg/mL，但是對(duì)氯霉素和氨芐青霉素并沒有明顯地影響。GSSG和GSH具有相同的功能，也可以改變PAO1對(duì)抗生素的敏感性。在PAO1(△gor)和PAO1(△gshB)兩個(gè)突變株中，GSSG和GSH同時(shí)可以影響抗生素的敏感性，其程度與野生型相同。上述結(jié)果顯示，GSH影響銅綠假單胞菌

8、對(duì)不同抗生素的敏感性與抗生素的種類密切相關(guān)，而與氧化型還是還原型谷光甘肽沒有關(guān)系，因此其作用可能不是通過改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)而起作用的。 總之， GSH一方面對(duì)exoS、exoY、phzAl和gacA等致病性基因的表達(dá)和PCN的產(chǎn)生起到促進(jìn)作用，一方面可以改變銅綠假單胞菌對(duì)不同抗生素的敏感性。本研究的結(jié)果對(duì)于GSH生物功能的重新認(rèn)識(shí)、GSH在銅綠假單胞菌感染過程中所扮演的角色，以及銅綠假單胞菌的致病性機(jī)理研究等方面具有較大的