早產(chǎn)胎膜早破危險(xiǎn)因素分析及其與MMPs基因多態(tài)性相關(guān)性研究.pdf

1、早產(chǎn)胎膜早破(preterm premature rupture of membrance,PPROM)是引起早產(chǎn)的主要因?yàn)橹?占到早產(chǎn)的25％,約30-40％的早產(chǎn)與PPROM有關(guān)。其中在妊娠36周前的PPROM會(huì)出現(xiàn)妊娠期較為嚴(yán)重的并發(fā)癥,其發(fā)病率近年來有增加趨勢(shì)。早產(chǎn)胎膜早破作為占早產(chǎn)因?yàn)?/3的產(chǎn)科并發(fā)癥,早預(yù)測(cè)早預(yù)防具有重大臨床意義,能一定程度降低早產(chǎn)率,提高孕產(chǎn)婦及新生兒生存率。
　　 長(zhǎng)期以來,胎膜早破是早產(chǎn)臨產(chǎn)

2、前的一種危機(jī),早產(chǎn)常與胎膜早破合并存在,胎膜早破使早產(chǎn)成為不可避免,兩者互為因果。因此,對(duì)PPROM高危因素的分析對(duì)其早預(yù)防早診治顯得尤為重要,具有一定臨床意義。國(guó)內(nèi)外大量研究顯示基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一族能降解細(xì)胞外基質(zhì)中所有蛋白成分的內(nèi)源性酶,對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中相應(yīng)成分的降解,可調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)含量和胎膜結(jié)構(gòu),引起胎膜組織結(jié)構(gòu)的弱化,從而導(dǎo)致胎膜早破發(fā)生。隨著研究深入,對(duì)于早產(chǎn)胎膜早破的病因?qū)W研究已進(jìn)入基因水平。研究發(fā)現(xiàn)由于母體與胎

3、兒之間的MMPs基因多態(tài)性現(xiàn)象與PPROM有關(guān),導(dǎo)致存在易感基因的孕婦發(fā)生PPROM的風(fēng)險(xiǎn)也就增加。易感基因的特點(diǎn)是基因的變異本身并不直接導(dǎo)致疾病的發(fā)生,而只造成機(jī)體患病的潛在危險(xiǎn)性增加,一旦外界有害因素介入,即可導(dǎo)致疾病發(fā)生。不同群體和個(gè)體對(duì)疾病的易感性、抵抗性以及其他生物學(xué)性狀有差別,其遺傳學(xué)基礎(chǔ)是人類基因組DNA序列的變異性,其中最常見的是SNP。近期有國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)胎兒MMP家族的遺傳變異中MMP-1、MMP-9、MMP-8轉(zhuǎn)

4、錄啟動(dòng)子區(qū)域的某些基因多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與PPROM有關(guān)。
　　 但是,目前對(duì)于與PPROM發(fā)病機(jī)制相關(guān)的MMPs SNP篩查,以及其基因多態(tài)性結(jié)合母體因素共同研究分析其發(fā)病因?yàn)榈难芯坎欢?且僅限于其中某一種基因并且研究都是針對(duì)美洲及非裔美洲人種。對(duì)于亞洲人種(中國(guó))這方面的研究暫未見報(bào)道。
　　 目的
　　 本研究將立足早產(chǎn)胎膜早破為契機(jī),從分子及蛋白

5、水平上研究PPROM與其胎膜組織上的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)量之間相關(guān)性并進(jìn)行驗(yàn)證,同時(shí)在基因水平上進(jìn)一步研究PPROM與基質(zhì)金屬蛋白酶基因多態(tài)性之間相關(guān)性,并結(jié)合PPROM相關(guān)高危因素共同分析三者相互關(guān)系,探討基質(zhì)金屬蛋白酶基因多態(tài)性與母體因素共同作用對(duì)PPROM易感性影響,旨在為早期預(yù)測(cè)早期預(yù)防PPROM提供科研依據(jù),提高母嬰生存率及生存質(zhì)量有重大臨床意義。
　　 方法
　　 一、早產(chǎn)胎膜早破相關(guān)高危因素分析
　　

6、 選擇2009年5月至2010年1月,在廣州、深圳市三甲(廣州南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院、廣州醫(yī)學(xué)院附屬三院、深圳市婦嬰醫(yī)院、深圳市羅湖人民醫(yī)院)及二甲醫(yī)院(南方醫(yī)科大學(xué)附屬三院華瑞醫(yī)院、廣州武警總隊(duì)醫(yī)院番禺分院、深圳市西麗人民醫(yī)院)住院分娩的早產(chǎn)胎膜早破的孕婦共78例,足月胎膜早破的孕婦107例,自發(fā)性早產(chǎn)的孕婦59例,各組均在同一時(shí)期按一定比例在各家醫(yī)院抽取,同時(shí)隨機(jī)抽取同時(shí)期入院分娩的正常足月產(chǎn)的孕婦171例。對(duì)每一位研究對(duì)象入院后

7、進(jìn)行病史詢問,并記錄孕婦年齡、體重、戶籍情況、文化水平、職業(yè)、健康情況、系統(tǒng)產(chǎn)檢與否。并詢問是否既往早產(chǎn)或早產(chǎn)胎膜早破史、孕期陰道流血史、孕期生殖道炎癥史、宮頸機(jī)能不全或?qū)m頸管～30mm、絨毛膜羊膜炎、吸煙或被動(dòng)吸煙、羊水過多、雙胎妊娠、人工流產(chǎn)次數(shù)、孕期羊膜腔穿刺術(shù)或胎兒鏡檢查、孕期額外補(bǔ)充維生素等。臨床病史資料由各位孕婦管床醫(yī)師協(xié)助完成詢問并記錄,并經(jīng)過患者知情同意。原始病歷資料統(tǒng)一輸入EXCEL電子表格之后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

8、　　 二、胎膜組織中MMPs(MMP-1,MMP-2,MMP-3,MMP-7,MMP-8,MMP-9)表達(dá)差異的研究
　　 1、采集研究對(duì)象外周靜脈血提取DNA,應(yīng)用熒光定量PCR反應(yīng)(SYBR Green法Real-time PCR)方法分析MMPs mRNA含量:熒光定量?jī)xABI 7500全自動(dòng)熒光定量PCR儀檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后,由電腦自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果。結(jié)果按拷貝數(shù)分析,用B表示,即B=拷貝數(shù)/μlcDNA。考慮到各個(gè)樣本總

9、RNA濃度的差異,最終計(jì)算結(jié)果按下列公式換算:A=B1(目的基因)÷B2(內(nèi)參基因)。
　　 2、采集研究對(duì)象胎膜組織提取RNA,應(yīng)用Western-blot法分析胎膜組織上MMPs蛋白表達(dá)量:以GAPDH為內(nèi)參,每組均相同條件重復(fù)3次,待膜干后對(duì)其進(jìn)行掃描保存,圖像處理系統(tǒng)分析顯色條帶灰度值以判斷蛋白含量高低。各組MMPs在胎膜組織中均有不同程度表達(dá)并進(jìn)一步驗(yàn)證了Real-time PCR法定量的結(jié)果。
　　 三、早產(chǎn)

10、胎膜早破與基質(zhì)金屬蛋白酶基因多態(tài)性及母體因素關(guān)聯(lián)性研究
　　 應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF)檢測(cè)MMPs(MMP-1,MMP-2,MMP-3,MMP-7,MMP-8,MMP-9)的多個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性之后,由各組質(zhì)譜圖的信號(hào)峰可看出MMPs各SNP位點(diǎn)中:MMP-8(rs1320632、rs2155052),MMP-9(rs3918242)僅出現(xiàn)一個(gè)T基因型信號(hào)峰,未出現(xiàn)多態(tài)性表現(xiàn),因此剔除。余下各位點(diǎn)

11、分析其多態(tài)性即SNP基因型在病例對(duì)照組中的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡并計(jì)算基因型、等位基因型分布頻率及其結(jié)合母體因素分析與PPROM的關(guān)聯(lián)性。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)學(xué)描述采用-x±s,計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比表示。計(jì)量資料兩組組間差別比較采用成組t檢驗(yàn),若方差不齊采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；多組組間差異比較采用方差分析,組間兩兩比較采用L

12、SD-t檢驗(yàn),若方差不齊,采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn),多重檢驗(yàn)校正采用Bonferroni校正。計(jì)數(shù)資料的組間差異比較采用x2檢驗(yàn)、兩兩比較采用分割x2檢驗(yàn)、單因素和多因素Logistic回歸分析。采用陳大方,陳常中專著中SAS宏程序進(jìn)行Hard-weinberg遺傳平衡檢驗(yàn),并計(jì)算基因型、等位基因型分布頻率。采用x2檢驗(yàn)、兩兩比較采用分割x2檢驗(yàn)、單因素和多因素Logis

13、tic回歸分析進(jìn)行組間基因型、等位基因分布差異檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論
　　 一、與早產(chǎn)胎膜早破有關(guān)的保護(hù)因素有:孕期增重、系統(tǒng)產(chǎn)檢、人工流產(chǎn)次數(shù)少于1次；相關(guān)的危險(xiǎn)因素有:既往早產(chǎn)或早產(chǎn)胎膜早破史、孕期陰道流血史、絨毛膜羊膜炎、吸煙或被動(dòng)吸煙。
　　 二、早產(chǎn)胎膜早破組與正常足月產(chǎn)組比較,早產(chǎn)胎膜早破組MMP1,MMP2,MMP3,MMP7,MMP9表達(dá)增高,而兩組MMP8表達(dá)無明

14、顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 三、MMP1(rs1799750)G.DEL基因型、MMP2(rs2285053)CT基因型、MMP2(rs2285052)CA基因型與早產(chǎn)胎膜早破發(fā)生存在關(guān)聯(lián)性。MMP2(rs243865)T等位基因、MMP2(rs2285052)A等位基因、攜帶MMP2(rs243866)G等位基因、MMP2(rs2285053)T等位基因與早產(chǎn)胎膜早破發(fā)生也存在關(guān)聯(lián)性。
　　 四、有孕期陰道流血史,有絨毛膜羊

15、膜炎,有吸煙或被動(dòng)吸煙史等外界母體因素均能影響MMP1(rs1799750)GG基因型,MMP2(rs2285053)CC基因型,它們均是危險(xiǎn)因素；而早產(chǎn)胎膜早破的保護(hù)因素有:攜帶MMP2(rs2285052)CC基因型、孕期有系統(tǒng)產(chǎn)檢；
　　 五、有既往早產(chǎn)或早產(chǎn)胎膜早破史,有孕期陰道流血史,有絨毛膜羊膜炎,有吸煙或被動(dòng)吸煙史等母體因素均能影響MMP8(rs11225395)A等位基因,且均為早產(chǎn)胎膜早破的危險(xiǎn)因素；而早產(chǎn)胎膜