瞬時(shí)感受器電位M7通道在RBL-2H3細(xì)胞的表達(dá)及功能研究.pdf

1、支氣管哮喘是一種由多種因素引起的，以可逆性氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病。目前全世界約有3億哮喘患者，患病率大約以每年1％的速度遞增，尤其以兒童哮喘的患病率上升顯著。現(xiàn)有的治療方案包括糖皮質(zhì)激素、支氣管擴(kuò)張劑、白三烯調(diào)節(jié)劑等并不能滿足部分哮喘患者的治療需求，每年死于哮喘病的患者有18萬(wàn)之多，而且近期哮喘的死亡率在世界范圍內(nèi)均呈直線上升。哮喘的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前的觀點(diǎn)認(rèn)為IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞被激活所致的Ⅰ型超敏

2、反應(yīng)是哮喘發(fā)病的重要因素。機(jī)體在暴露于抗原后，樹(shù)突狀細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞相互作用并導(dǎo)致Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促使B細(xì)胞生成IgE并通過(guò)肥大細(xì)胞表面與IgE抗體Fc段呈高親和力的受體(FcεRI)結(jié)合，使機(jī)體處于對(duì)該抗原的致敏狀態(tài)。當(dāng)相應(yīng)抗原再次進(jìn)入機(jī)體時(shí)通過(guò)與致敏肥大細(xì)胞表面兩個(gè)或兩個(gè)以上相鄰IgE抗體特異性結(jié)合，使膜表面FcεRI交聯(lián)活化并最終導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒并導(dǎo)致后續(xù)的炎癥反應(yīng)。目前認(rèn)為β-氨基已糖苷酶是監(jiān)測(cè)肥大細(xì)胞脫顆粒釋放的

3、標(biāo)志。
　　 鈣離子在肥大細(xì)胞活化后的脫顆粒反應(yīng)起重要作用。當(dāng)FcεRI受體激活后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度呈雙相升高，最初的短暫的鈣離子濃度升高目前機(jī)制已較明確，主要通過(guò)生成三磷酸肌醇使存儲(chǔ)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋出，升高胞漿Ca2+水平。但這個(gè)過(guò)程鈣離子濃度呈一過(guò)性的升高，是一個(gè)瞬時(shí)變化，并不能滿足細(xì)胞的持久反應(yīng)，隨后持續(xù)的胞內(nèi)鈣離子濃度升高才是肥大細(xì)胞參與病理生理活動(dòng)的關(guān)鍵。但是，究竟哪些離子通道介導(dǎo)了鈣離子內(nèi)流目前尚未完全明確。

4、r>　　 興奮性細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流主要依靠電壓操縱性鈣通道。但是作為非興奮性細(xì)胞，肥大細(xì)胞缺乏電壓操縱性鈣通道。瞬時(shí)感受器電位通道(TRP)為鈣庫(kù)操控性鈣離子內(nèi)流(SOCE)通道，包括7個(gè)亞家族，其中TRPM亞家族含有8個(gè)成員(TrM1-TRPM8)，因其作為與鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)系的通道一直為學(xué)者們所關(guān)注。瞬時(shí)感受器電位M7(TRPM7)是TRPM的重要成員之一，有研究表明它可介導(dǎo)鈣離子和鎂離子內(nèi)流，消除DT-40 B淋巴細(xì)胞的TRPM7立

5、即引起細(xì)胞成長(zhǎng)停止和死亡，顯示TRPM7引起的鈣流入對(duì)該細(xì)胞的存活起關(guān)鍵作用；最近的研究表明TRPM7在人類肥大細(xì)胞上有表達(dá)并對(duì)肥大細(xì)胞存活有重要作用。因此，TRPM7有可能是肥大細(xì)胞上一個(gè)重要的介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流的通道。
　　 因此，本研究選擇大鼠RBL-2H3細(xì)胞作為研究對(duì)象，首先檢測(cè)RBL-2H3細(xì)胞TRPM7通道的表達(dá)及表達(dá)部位，然后再構(gòu)建TRPM7-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過(guò)TRP通道阻斷劑2-APB抑制TRPM7功能

6、及逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RNA干擾下調(diào)TRPM7表達(dá)，觀察TRPM7通道在RBL-2H3細(xì)胞的存活、凋亡以及抗原活化中的作用，初步研究RBL-2H3細(xì)胞TRPM7的功能，為揭示TRPM7通道參與肥大細(xì)胞病理生理活動(dòng)提供堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。
　　 第一章瞬時(shí)感受器電位M7通道在RBL-2H3細(xì)胞的表達(dá)
　　 研究目的：
　　 明確TRPM7通道在RBL-2H3細(xì)胞的表達(dá)情況。
　　 研究方法：
　　 RT-P

7、CR檢測(cè)RBL-2H3細(xì)胞TRPM家族mRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)RBL-2H3細(xì)胞TRPM7蛋白的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)TRPM7通道在RBL-2H3的表達(dá)部位。
　　 結(jié)論：
　　 TRPM7通道表達(dá)于在RBL-2H3細(xì)胞并主要位于細(xì)胞膜。
　　 第二章TRPM7-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建
　　 研究目的：
　　 構(gòu)建攜帶大鼠TRPM7-siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

8、>　　 研究方法：
　　 設(shè)計(jì)3個(gè)TRPM7-siRNA序列和1個(gè)無(wú)關(guān)對(duì)照序列，克隆到酶切的pSuper-retro-neo-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。重組質(zhì)粒采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染RBL-2H3細(xì)胞，通過(guò)Western blot檢測(cè)干擾效率。篩選出最有效的pSuper-retro-neo-GFP-siTRMP7與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞生成逆轉(zhuǎn)錄病毒；逆轉(zhuǎn)錄病毒感染RBL-2H3細(xì)胞，熒光實(shí)時(shí)定量P

9、CR及Western blot檢測(cè)TRPM7-siRNA的沉默效果。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建大鼠TRPM7-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，為研究TRPM7的功能提供了有力的工具。
　　 第三章瞬時(shí)感受器電位M7通道在RBL-2H3細(xì)胞的功能研究
　　 研究目的：
　　 明確TRPM7通道在RBL-2H3細(xì)胞存活、凋亡及抗原活化的作用。
　　 研究方法：
　　 1、以TRP通道阻斷

10、劑2-APB抑制TRPM7功能及TRPM7-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染RBL-2H3細(xì)胞，通過(guò)MTT、流式細(xì)胞術(shù)以及TUNEL-FITC/Hoechst33258檢測(cè)比較不同處理后RBL-2H3細(xì)胞數(shù)及凋亡率的變化及差異，觀察TRPM7通道在RBL-2H3細(xì)胞存活及凋亡的作用；
　　 2、以DNP-IgE致敏過(guò)夜后再用抗原DNP-BSA激活RBL-2H3細(xì)胞，測(cè)定β-氨基已糖苷酶的含量及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化；以TRP通道阻斷劑