尼古丁對(duì)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及膜瞬時(shí)受體電位通道TRPC表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 COPD發(fā)病與多種因素有關(guān)，吸煙是導(dǎo)致COPD的最主要原因[3]，一般認(rèn)為，人體吸入香煙后，煙霧中的有害物質(zhì)致使肺組織內(nèi)出現(xiàn)氧化抗氧化失衡，炎癥細(xì)胞活化，蛋白酶抗蛋白酶失衡，細(xì)胞凋亡等一系列變化，最終發(fā)展成為COPD[5]。但是吸煙引起COPD的機(jī)制尚不清楚，闡述其確切機(jī)制對(duì)防治COPD意義十分重大。香煙中的主要有害成分是Nicotine，香煙進(jìn)入人體最先直接接觸人體的氣道。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察Nicotine刺激大鼠

2、氣道平滑肌細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子濃度的改變及平滑肌細(xì)胞膜上非選擇性陽(yáng)離子通道瞬時(shí)受體電位通道TRPC1和TPRC6mRNA表達(dá)水平變化，初步探討Nicotine在COPD氣道重塑發(fā)生中的可能作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 一、大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)：用顯微技術(shù)分離大鼠遠(yuǎn)端氣道平滑肌組織，采用酶消化法進(jìn)行原代培養(yǎng)，運(yùn)用形態(tài)學(xué)觀察和平滑肌細(xì)胞α-actin免疫熒光鑒定細(xì)胞。
　　 二、Nicotine對(duì)大

3、鼠遠(yuǎn)端氣道平滑肌細(xì)胞基礎(chǔ)鈣離子濃度的影響：將實(shí)驗(yàn)分成5組，分別用不同濃度的Nicotine（10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml）刺激原代培養(yǎng)的大鼠氣道平滑肌細(xì)胞，正常對(duì)照細(xì)胞不施加干預(yù)因素。分別于培養(yǎng)24小時(shí)及48小時(shí)后，用Incyte細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測(cè)系統(tǒng)觀察大鼠ASMCs[Ca2+]I的變化。
　　 三、Nicotine對(duì)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞膜瞬時(shí)受體電位通道TRPC1和TPRC6mRNA表達(dá)的影響

4、：實(shí)驗(yàn)取原代培養(yǎng)的大鼠氣道平滑肌細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、分別用不同濃度Nicotine（10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml）刺激組，分別于刺激24小時(shí)和48小時(shí)后，提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，建立穩(wěn)定的Realtime-PCR方法，定量分析大鼠氣道平滑肌細(xì)胞膜瞬時(shí)受體電位通道TRPC1和TPRC6 mRNA在正常氣道平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)及Nicotine刺激后表達(dá)量的變化。
　　 結(jié)

5、果：
　　 一、用改進(jìn)后的酶消化法成功培養(yǎng)了大鼠原代ASMCs，該原代培養(yǎng)的大鼠ASMCs不僅表現(xiàn)出典型的平滑肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)特征，而且具有完好的生理學(xué)功能。
　　 二、不同濃度Nicotine（20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml）刺激大鼠ASMCs24小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子濃度(nM) 117.99 19.39，122.89 17.91，124.70 17.93較對(duì)照組85.8512.60明顯升高

6、，（p<0.05）；。以不同濃度Nicotine（20ng/ml，50ng/ml,100ng/ml）刺激48小時(shí)后鈣離子濃度(nM)分別為：142.07 18.99，162.27 19.91，207.30 26.56，較對(duì)照組98.04 2.39明顯升高，（p值<0.05）。100ng/ml尼古丁刺激大鼠ASMCs48小時(shí)組和刺激24小時(shí)組比較細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子濃度明顯升高（P<0.05）。
　　 三、正常大鼠ASMCs中有TRP

7、C1、4、6mRNA的表達(dá)。Nicotine刺激能夠促進(jìn)TRPC1和TPRC6mRNA表達(dá)。20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml刺激大鼠ASMcs24小時(shí)或48小時(shí)后，TRPC1和TPRC6mRNA表達(dá)均增強(qiáng)。刺激24小時(shí)，TRPC1和TPRC6 mRNA 相對(duì)濃度(TRPC/β-actin×10-4)分別為：TRPC1：2.950.48，3.42 0.86，3.26 0.98，對(duì)照組為2.39 0.64；TRPC6：4.7

8、4 2.30，5.19 2.60，4.79 1.44，對(duì)照組為3.09 1.39。刺激48小時(shí)后相對(duì)濃度分別為：TRPC1：5.26 2.36，5.83 2.55，6.14 2.28，對(duì)照組為4.00 1.81；TRPC6：9.23 4.38，11.30 3.57（分別以50ng/ml、100ng/ml nicotine刺激后），對(duì)照組為6.02 3.50。和對(duì)照組比較，TRPC1和TPRC6 mRNA 相對(duì)濃度均顯著升高，p均<0.0