SynaptotagminⅡ在RBL-2H3胞吐中的作用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分:SynaptotagminⅡ在RBL-2H3的表達(dá)、定位及在胞吐中的作用研究 目的: 1.研究SynaptotagminⅡ(簡稱Syt2)是否在大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞(RBL-2H3,簡稱RBL)中表達(dá)。 2.研究Syt2在RBL細(xì)胞中的分布。 3.研究Syt2在RBL細(xì)胞中過表達(dá)對(duì)RBL細(xì)胞胞吐的影響,分析Syt2在RBL細(xì)胞胞吐中的作用。 方法: 1.采用Westernblot

2、檢測Syt2在RBL中的表達(dá)情況。 2.用高保真酶擴(kuò)增Syt2,構(gòu)建pEGFP-N1-Syt2表達(dá)質(zhì)粒,電穿孔轉(zhuǎn)染RBL,通過G418篩選和有限稀釋獲得穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白Syt2-EGFP的細(xì)胞。 3.通過鈣離子載體和抗原刺激,分別檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞分泌的β-氨基已糖苷酶、5-羥色胺和組織蛋白酶D,分析Syt2對(duì)胞吐的影響。 結(jié)果: 1.Westernblot結(jié)果顯示Syt2在RBL中表達(dá)。

3、 2.構(gòu)建了pEGFP-N1-Syt2質(zhì)粒,插入片段測序結(jié)果與GeneBank登錄號(hào)NM012665(ratSyt2)序列完全一致。經(jīng)轉(zhuǎn)染和篩選,獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞RBL-Syt2-S。RBL-Syt2-S不僅表達(dá)內(nèi)源性Syt2,而且表達(dá)融合蛋白Syt2-EGFP。通過觀察綠色熒光蛋白(GFP)在RBL-Syt2-S中的位置,得知Syt2主要位于RBL細(xì)胞的胞膜,在胞漿內(nèi)僅有少量表達(dá)。 3.經(jīng)刺激后,RBL-Syt2-S分泌的β

4、-氨基已糖苷酶和5-羥色胺與對(duì)照相比無明顯區(qū)別,但其分泌的組織蛋白酶D較對(duì)照減少一半,結(jié)果說明Syt2在RBL細(xì)胞中過表達(dá)抑制了RBL溶酶體胞吐。 結(jié)論:1.Syt2在RBL中表達(dá)。 2.Syt2主要在RBL細(xì)胞的胞膜上表達(dá),在胞漿內(nèi)僅有少量表達(dá)。 3.Syt2對(duì)于RBL溶酶體胞吐起負(fù)調(diào)控作用。 第二部分:反義RNA抑制synaptotagminⅡ在RBL-2H3的表達(dá)及對(duì)胞吐的作用目的研究Syt2在R

5、BL中表達(dá)減弱對(duì)RBL細(xì)胞胞吐的影響,分析Syt2在RBL細(xì)胞胞吐中的作用。 方法: 1.用高保真酶擴(kuò)增Syt2,與pEGFP-N1構(gòu)建全長反義基因表達(dá)載體,電穿孔轉(zhuǎn)染RBL,通過G418篩選和有限稀釋獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 2.通過鈣離子載體和抗原刺激,分別檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞分泌的β-氨基已糖苷酶、5-羥色胺和組織蛋白酶D、,分析Syt2在RBL中表達(dá)減弱對(duì)RBL細(xì)胞胞吐的影響。 結(jié)果: 1

6、.構(gòu)建了pEGFP-N1-Syt2-AS質(zhì)粒,插入片段測序結(jié)果與GeneBank登錄號(hào)NM012665(ratSyt2)序列完全一致。經(jīng)轉(zhuǎn)染和G418篩選,獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞RBL-Syt2-AS,Westernblot結(jié)果顯示,兩株RBL-Syt2-AS表達(dá)的Syt2均明顯減少,分別只有對(duì)照的8%和10%。 2.經(jīng)刺激后,RBL-Syt2-AS分泌的β-氨基已糖苷酶與對(duì)照相比明顯增加,最高比對(duì)照增加3.5倍;RBL-Syt2-

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