SynaptotagminⅡ在RBL-2H3胞吐中的作用研究.pdf

1、第一部分：SynaptotagminⅡ在RBL-2H3的表達、定位及在胞吐中的作用研究 目的: 1.研究SynaptotagminⅡ(簡稱Syt2)是否在大鼠嗜堿性白血病細胞(RBL-2H3，簡稱RBL)中表達。 2.研究Syt2在RBL細胞中的分布。 3.研究Syt2在RBL細胞中過表達對RBL細胞胞吐的影響，分析Syt2在RBL細胞胞吐中的作用。 方法: 1.采用Westernblot

2、檢測Syt2在RBL中的表達情況。 2.用高保真酶擴增Syt2，構(gòu)建pEGFP-N1-Syt2表達質(zhì)粒，電穿孔轉(zhuǎn)染RBL，通過G418篩選和有限稀釋獲得穩(wěn)定表達融合蛋白Syt2-EGFP的細胞。 3.通過鈣離子載體和抗原刺激，分別檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞和對照細胞分泌的β-氨基已糖苷酶、5-羥色胺和組織蛋白酶D，分析Syt2對胞吐的影響。 結(jié)果: 1.Westernblot結(jié)果顯示Syt2在RBL中表達。

3、 2.構(gòu)建了pEGFP-N1-Syt2質(zhì)粒，插入片段測序結(jié)果與GeneBank登錄號NM012665(ratSyt2)序列完全一致。經(jīng)轉(zhuǎn)染和篩選，獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞RBL-Syt2-S。RBL-Syt2-S不僅表達內(nèi)源性Syt2，而且表達融合蛋白Syt2-EGFP。通過觀察綠色熒光蛋白(GFP)在RBL-Syt2-S中的位置，得知Syt2主要位于RBL細胞的胞膜，在胞漿內(nèi)僅有少量表達。 3.經(jīng)刺激后，RBL-Syt2-S分泌的β

4、-氨基已糖苷酶和5-羥色胺與對照相比無明顯區(qū)別，但其分泌的組織蛋白酶D較對照減少一半，結(jié)果說明Syt2在RBL細胞中過表達抑制了RBL溶酶體胞吐。 結(jié)論:1.Syt2在RBL中表達。 2.Syt2主要在RBL細胞的胞膜上表達，在胞漿內(nèi)僅有少量表達。 3.Syt2對于RBL溶酶體胞吐起負調(diào)控作用。 第二部分:反義RNA抑制synaptotagminⅡ在RBL-2H3的表達及對胞吐的作用目的研究Syt2在R

5、BL中表達減弱對RBL細胞胞吐的影響，分析Syt2在RBL細胞胞吐中的作用。 方法: 1.用高保真酶擴增Syt2，與pEGFP-N1構(gòu)建全長反義基因表達載體，電穿孔轉(zhuǎn)染RBL，通過G418篩選和有限稀釋獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。 2.通過鈣離子載體和抗原刺激，分別檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞和對照細胞分泌的β-氨基已糖苷酶、5-羥色胺和組織蛋白酶D、，分析Syt2在RBL中表達減弱對RBL細胞胞吐的影響。 結(jié)果: 1

6、.構(gòu)建了pEGFP-N1-Syt2-AS質(zhì)粒，插入片段測序結(jié)果與GeneBank登錄號NM012665(ratSyt2)序列完全一致。經(jīng)轉(zhuǎn)染和G418篩選，獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞RBL-Syt2-AS，Westernblot結(jié)果顯示，兩株RBL-Syt2-AS表達的Syt2均明顯減少，分別只有對照的8％和10％。 2.經(jīng)刺激后，RBL-Syt2-AS分泌的β-氨基已糖苷酶與對照相比明顯增加，最高比對照增加3.5倍；RBL-Syt2-