利用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)造油菜脂肪酸變異新資源.pdf

1、油菜是我國重要的油料作物之一。進一步提高油酸含量適當降低亞麻酸含量是油菜品質(zhì)改良的重要內(nèi)容，而獲得高油酸和低亞麻酸資源是開展育種工作的基礎(chǔ)。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對控制油菜種子中油酸含量的FAD2及亞麻酸含量的FAD3基因進行定點編輯，并通過對轉(zhuǎn)基因后代的連續(xù)自交和回交，獲得了不帶有轉(zhuǎn)基因元件的高油酸低亞麻酸突變體。主要研究結(jié)果如下:
　　1.對甘藍型油菜FAD2與FAD3基因進行生物信息學(xué)分析，使用在線軟件篩選出

2、基因編輯靶點，構(gòu)建了對油菜FAD2與FAD3基因靶點特異的CRISPR/Cas9植物表達載體。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化油菜品系J9707，獲得了143株轉(zhuǎn)FAD2靶基因和169株轉(zhuǎn)FAD3靶基因轉(zhuǎn)基因油菜。
　　2.通過非變性PAGE膠檢測了所有的轉(zhuǎn)基因陽性植株，并挑選出部分突變單株進行了測序分析。本研究對FAD2靶基因的編輯效率為16％，而對FAD3的編輯效率為5％。FAD2突變體測序與靶基因核酸序列比對表明，單個堿基插

3、入是主要的突變類型，占到各種突變類型的50％以上，同時還發(fā)現(xiàn)有2個至13個堿基缺失的多種突變類型。部分FAD3突變體測序結(jié)果檢測到G-A堿基的替換和2個堿基AC的插入的突變。
　　3.對FAD2基因在2個靶點各個拷貝突變效率進行了比較分析。針對第一個靶位點，BnaA.FAD2.a與BnaC.FAD2.a拷貝的突變效率為分別為53％和29％;而BnaA.FAD2.b與BnaC.FAD2.b拷貝雖然只在靶標序列的第一個堿基處有差異，前

4、者的突變率為18％，BnaC.FAD2.b拷貝未檢測到突變。統(tǒng)計結(jié)果還發(fā)現(xiàn)PAM序列對突變效率有較大影響。在第二個靶點位置，BnaA.FAD2.α拷貝的PAM序列為-GGG，突變效率為71％，然而PAM序列為-NGA的其他拷貝均未出現(xiàn)突變。
　　4.突變單株自交及雜交后代基因型分析表明，雜合突變單株后代基因型的分離比符合孟德爾遺傳規(guī)律。本研究在T0代沒有編輯的陽性單株后代株系中檢測到了突變單株，也觀測到有些在T0代葉片中檢測到突變