利用基因組編輯技術(shù)TALENs研究急性白血病DNMT3A突變的分子機(jī)制.pdf

1、成人急性淋巴細(xì)胞白血病DNMT3A基因突變研究
　　目的:本研究旨在探討成人急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）患者中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNA methyltransferase，DNMT3A）突變發(fā)生的頻率、與其他臨床特征間的相關(guān)性以及對患者預(yù)后的影響。
　　方法:收集57例急性淋巴細(xì)胞白血病患者的骨髓或外周血細(xì)胞，使用Ficoll梯度離心法分離單個核細(xì)胞，提取基因組D

2、NA后采用PCR的方法對DNMT3A熱點突變所在的第23號外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后測序，與正?；蚪M序列比對篩查突變結(jié)果。通過本科室生物標(biāo)本庫獲取57例患者相關(guān)臨床特征信息并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:在57例ALL患者中，共檢測出3例（5.3％）攜帶DNMT3A R882H突變。T-ALL患者中突變的發(fā)生率明顯高于B-ALL患者（P=0.048）。年齡在40至60歲之間的患者與其他年齡組相比具有更高的突變發(fā)生率（P=0.0

3、42）。在全部患者中和T-ALL中，攜帶DNMT3A突變的患者與野生型患者相比整體生存期較短（P=0.02和P=0.014）。
　　結(jié)論： DNMT3A突變在 ALL中發(fā)生率較低，突變患者其整體生存期明顯縮短，提示該突變對成人ALL患者的危險分級和治療具有重要的意義。
　　392例成人急性髓系白血病DNMT3A基因突變研究
　　目的:本研究旨在研究成人急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML

4、）患者中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNA methyltransferase，DNMT3A）突變發(fā)生的頻率、與其他臨床特征間的相關(guān)性以及對患者預(yù)后的影響。
　　方法:收集392例成人急性髓系白血病患者的骨髓或外周血細(xì)胞，使用Ficoll梯度離心法從中獲取單個核細(xì)胞，提取基因組DNA后采用PCR的方法對DNMT3A熱點突變所在的第23號外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化之后測序，最后與正?；蚪M序列比對判讀突變結(jié)果。通過本科室生物標(biāo)本庫獲取

5、392例患者相關(guān)臨床特征信息并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:在392例AML患者中，共檢測出37例（9.44%）攜帶DNMT3A R882突變，其中DNMT3A R882H29例（78.38%），R882C8例（21.62%）。DNMT3A突變陽性患者與野生型患者相比，年齡明顯偏大，但在性別、白細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白水平、血小板計數(shù)和初診時原始細(xì)胞比例等方面無明顯差異。DNMT3A突變主要集中于M4和M5中，與NPM1突變和FLT3-IT

6、D突變之間存在明顯正相關(guān)性（P<0.001）。在染色體核型分析中，DNMT3A突變主要集中在 CN-AML中（83.78%，31/37，P<0.001）以及中危組中（91.89%，34/37，P<0.001）。生存分析顯示，在整體 AML和CN-AML患者中，DNMT3A突變陽性患者和野生型患者相比，OS（P=0.0218和P=0.0006）和EFS（P=0.0203和P=0.0006）均明顯縮短。在CN-AML中，多因素分析結(jié)果顯示D

7、NMT3A突變可以作為一個獨立的預(yù)后因素，提示較短的整體生存期（HR=1.986,95%CI1.207 to3.269，P=0.007）。
　　結(jié)論：DNMT3A突變在AML中發(fā)生頻率較高，并且對患者預(yù)后具有不良影響，提示該突變對成人AML患者預(yù)后危險分級和治療方案的選擇具有重要的意義。
　　利用基因組編輯技術(shù)TALENs研究急性白血病DNMT3A突變的分子機(jī)制
　　目的：我們研究的目的在于利用TALENs技術(shù)構(gòu)建一株

8、攜帶 DNMT3A突變的 K562細(xì)胞系，并研究該突變對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響。
　　方法:設(shè)計并使用快速模塊組裝法構(gòu)建 DNMT3A-TALEN質(zhì)粒。TALEN質(zhì)粒和供者質(zhì)粒一起電轉(zhuǎn)入K562細(xì)胞，之后用PCR的方法篩選攜帶DNMT3A R882H突變的克隆。用全外顯子測序的方法檢測DNMT3A-TALEN質(zhì)?？赡艽嬖诘拿摪行?yīng)。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測DNMT3A和SLC7A11基因蛋白水平的表達(dá)變化?？寺⌒纬稍囼灪虲FSE實驗檢

9、測突變克隆的增殖能力。用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:本研究中，我們首次使用TALENs技術(shù)成功構(gòu)建了一株攜帶DNMT3A R882H突變的K562細(xì)胞系?？寺⌒纬稍囼灪虲FSE實驗證實該突變可以明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖。表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示一些與GSH合成相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)明顯升高，包括CTH，PSPH，PSAT1特別是 SLC7A11（胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運體），從而導(dǎo)致突變克隆細(xì)胞內(nèi)GSH含量升高。此外，檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示突