利用基因組編輯技術研究非編碼RNA的關鍵轉錄調控元件.pdf

1、目的：
　　本研究針對XIST的敲低建立了在HEK293T細胞中的CRISPR/Cas9基因組編輯系統，以及利用該系統揭示非編碼基因miRNA-146a新的轉錄調控機制。
　　方法：
　　1.本研究利用CRISPR/Cas9系統和TALEN技術在HEK293T細胞中對已知的XIST的核心啟動子進行編輯,建立了通過酶切、測序等鑒定突變效率的方法,并且結合極限稀釋法、片段分析和TA克隆測序得到基因型確定的XIST低表達的單

2、克隆細胞系。
　　2.利用CRISPR/Cas9技術突變miRNA-146a多個潛在的轉錄調控區(qū)域，鑒定調控miRNA-146a轉錄的關鍵區(qū)域。
　　3.使用熒光定量PCR、熒光素酶報告基因、DNA甲基化分析和染色質免疫沉淀等技術揭示miRNA-146a轉錄調控的新機制。
　　結果：
　　1.成功建立優(yōu)化后的針對HEK293T細胞進行基因組編輯的CRISPR/Cas9系統；CRISPR/Cas9和TALEN對XI

3、ST核心啟動子的突變可以有效地抑制XIST的表達。
　　2.位于miRNA-146a初級轉錄本內含子區(qū)的單堿基chr5:159912213(GRCh37/hg19)的缺失導致顯著的miRNA-146a的轉錄上調。
　　3.單堿基chr5:159912213(GRCh37/hg19)的缺失可導致整個miRNA-146a宿主基因的RNA轉錄產物的增加和RNA聚合酶II結合的增加。
　　結論：
　　1.針對XIST核心