桔小實(shí)蠅胰島素信號(hào)通路基因表達(dá)特性及功能研究.pdf

1、桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)隸屬雙翅目Diptera、實(shí)蠅科Tephritidae，是一種廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)的世界性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。該蟲(chóng)寄主范圍廣、適應(yīng)能力強(qiáng)、繁殖力高且擴(kuò)散能力強(qiáng)，是國(guó)際貿(mào)易的技術(shù)壁壘，被許多國(guó)家列為檢疫對(duì)象。桔小實(shí)蠅產(chǎn)卵于果實(shí)內(nèi)，幼蟲(chóng)潛居于果瓤中取食危害，導(dǎo)致果實(shí)腐爛、未熟先落，降低果蔬的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和食用價(jià)值。目前，由于化學(xué)藥劑的不科學(xué)使用，桔小實(shí)蠅對(duì)多種常用殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性。

2、因此，亟待尋找新的殺蟲(chóng)劑作用靶標(biāo)或研發(fā)綠色防控技術(shù)。昆蟲(chóng)胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝、生殖以及衰老等重要生理過(guò)程。因此，闡明桔小實(shí)蠅胰島素信號(hào)通路調(diào)控其變態(tài)發(fā)育的分子機(jī)制，可為尋找殺蟲(chóng)劑新的作用靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。
　　本學(xué)位論文以桔小實(shí)蠅為研究對(duì)象，利用RT-qPCR技術(shù)分析胰島素信號(hào)通路7個(gè)重要基因在桔小實(shí)蠅各生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和體段或組織中的表達(dá)模式；分析這些基因在20E和饑餓脅迫后的應(yīng)激表達(dá)模式；利用RNAi技術(shù)解

3、析這些基因的功能；最后，利用HPLC技術(shù)檢測(cè)沉默桔小實(shí)蠅BdFoxO后對(duì)其體內(nèi)蛻皮激素滴度的影響，進(jìn)一步闡明胰島素信號(hào)通路基因與蛻皮激素間的關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果將明確這些基因的功能以及調(diào)控方式，為桔小實(shí)蠅的持續(xù)防控提供新的思路和方法。主要研究結(jié)果如下：
　　1.桔小實(shí)蠅胰島素信號(hào)通路3個(gè)基因的時(shí)空表達(dá)模式分析
　　1.1 桔小實(shí)蠅胰島素信號(hào)通路3個(gè)基因在各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式
　　利用RT-qPCR技術(shù)解析胰島素信號(hào)通路3個(gè)重

4、要基因（BdFoxO、BdFBP、BdPEPCK）在桔小實(shí)蠅的各發(fā)育時(shí)期的mRNA表達(dá)模式。結(jié)果表明，BdFoxO在幼蟲(chóng)及蛹期的相對(duì)表達(dá)量較高，且最高表達(dá)量出現(xiàn)在幼蟲(chóng)孵化后的第1天；BdFBP在幼蟲(chóng)階段的相對(duì)表達(dá)量較高，其余發(fā)育時(shí)期間差異不顯著；BdPEPCK在蛹期相對(duì)表達(dá)量較高，成蟲(chóng)羽化后第1天的表達(dá)量最高。結(jié)合前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)胰島素信號(hào)通路基因在桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)及蛹期的相對(duì)表達(dá)量較高，說(shuō)明這些基因參與調(diào)控桔小實(shí)蠅的蛻皮過(guò)程。

5、>　　1.2 桔小實(shí)蠅胰島素信號(hào)通路3個(gè)基因在不同體段或組織中的表達(dá)模式
　　利用RT-qPCR技術(shù)解析胰島素信號(hào)通路3個(gè)重要基因（BdFoxO、BdFBP、BdPEPCK）在桔小實(shí)蠅頭部、胸部、腹部、卵巢、馬氏管、脂肪體及中腸7個(gè)不同體段或組織中的mRNA表達(dá)模式。結(jié)果表明，BdFoxO在中腸相對(duì)表達(dá)量最高，其后為脂肪體。BdFBP和BdPEPCK在脂肪體中表達(dá)量最高，且BdPEPCK在脂肪體的表達(dá)量是卵巢表達(dá)量的102.1倍。

6、脂肪體能夠整合多種營(yíng)養(yǎng)和激素信號(hào)調(diào)控昆蟲(chóng)個(gè)體和細(xì)胞大小，胰島素信號(hào)通路基因在桔小實(shí)蠅脂肪體相對(duì)較高水平的表達(dá)進(jìn)一步說(shuō)明這些基因可能影響其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。
　　2.20E和饑餓處理對(duì)桔小實(shí)蠅胰島素信號(hào)通路7個(gè)基因表達(dá)的影響
　　2.1 20E處理對(duì)桔小實(shí)蠅胰島素信號(hào)通路7個(gè)基因表達(dá)的影響
　　利用微量注射法，對(duì)桔小實(shí)蠅第5日齡幼蟲(chóng)注射不同劑量的20E，通過(guò)
　　RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)胰島素信號(hào)通路7個(gè)基因（Akt、P

7、DK、PI3K21B、InR、BdFoxO、BdFBP以及BdPEPCK）的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，除Akt在20E處理后相對(duì)表達(dá)水平顯著下調(diào)外，其余6個(gè)基因總體呈顯著上調(diào)趨勢(shì)。說(shuō)明在外源激素的刺激下，昆蟲(chóng)體內(nèi)胰島素信號(hào)通路基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)相應(yīng)調(diào)節(jié)變化，使體內(nèi)各激素間達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，從而維持自身體內(nèi)的穩(wěn)定。
　　2.2 饑餓處理對(duì)桔小實(shí)蠅胰島素信號(hào)通路7個(gè)基因表達(dá)的影響
　　利用RT-qPCR技術(shù)解析桔小實(shí)蠅胰島素信號(hào)通路7個(gè)基

8、因在饑餓處理后的表達(dá)水平變化。結(jié)果表明，除Akt及BdFBP在饑餓處理后顯著下調(diào)外，其余多數(shù)基因的表達(dá)顯著上調(diào)。推測(cè)桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)在受到饑餓脅迫后，可能通過(guò)胰島素信號(hào)通路基因間轉(zhuǎn)錄水平的相互協(xié)調(diào)加強(qiáng)體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而避免不良環(huán)境對(duì)自身種群延續(xù)產(chǎn)生的威脅。
　　3.桔小實(shí)蠅胰島素信號(hào)通路7個(gè)基因的功能初探
　　通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄法獲得高質(zhì)量dsRNA，借助微量注射法將外源dsRNA導(dǎo)入桔小實(shí)蠅4日齡幼蟲(chóng)體內(nèi)。RT-qPCR分析結(jié)果表明

9、，7個(gè)基因48h后沉默效率均在50％左右，沉默效率最高的在80%以上。分別檢測(cè)7個(gè)胰島素信號(hào)通路基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)7個(gè)基因相互之間存在不同程度的影響，說(shuō)明這些基因之間可能存在一系列反饋與負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。沉默后對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行表型觀察，發(fā)現(xiàn)大多胰島素信號(hào)通路基因沉默后對(duì)其幼蟲(chóng)化蛹時(shí)間產(chǎn)生一定的影響，推測(cè)與胰島素信號(hào)通路的基因沉默導(dǎo)致桔小實(shí)蠅發(fā)生某些生理變化有關(guān)。通過(guò)對(duì)注射dsBdFoxO的幼蟲(chóng)進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，沉默BdFoxO的幼蟲(chóng)體重明顯變重