中藥防齲藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的建立——口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn).pdf

1、齲病是人類最常見(jiàn)的口腔感染性疾病，嚴(yán)重危害口腔及全身健康。研究證實(shí)，齲病是由于口腔生態(tài)失衡造成正常菌群變?yōu)闂l件致病菌而引起。防止齲病的關(guān)鍵是調(diào)整口腔生態(tài)平衡，達(dá)到生態(tài)防治齲病。本研究組最早開(kāi)始中藥防齲的生態(tài)系列研究，在國(guó)內(nèi)外率先開(kāi)展中藥防齲藥物的篩選和防齲機(jī)制的初步研究。已建立了中藥防齲篩選體外實(shí)驗(yàn)方法，篩選出具有防齲效果的中藥，為深入研究中藥防齲的藥效學(xué)研究方法提供了實(shí)驗(yàn)藥物。藥效學(xué)是研究藥物對(duì)人體及病原體產(chǎn)生藥物效應(yīng)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的科

2、學(xué)。如何采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段說(shuō)明中藥的藥效學(xué)，使中藥為國(guó)際市場(chǎng)所接受，是目前中藥研究面臨的最重要、最關(guān)鍵的問(wèn)題，是使中藥打入國(guó)際市場(chǎng)，發(fā)揮中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)巨大優(yōu)勢(shì)的至關(guān)重要的一步。因此中藥藥效學(xué)的研究和評(píng)價(jià)方法對(duì)中藥的開(kāi)發(fā)、研制和利用有重要而深遠(yuǎn)的意義。目前國(guó)內(nèi)中藥研究已開(kāi)展多個(gè)系統(tǒng)的藥效學(xué)研究方法及評(píng)價(jià)，但是有關(guān)中藥防齲的藥效學(xué)研究方法及評(píng)價(jià)尚是空白。中藥防齲的研究應(yīng)結(jié)合現(xiàn)代藥效學(xué)研究新方法和新技術(shù)建立口腔細(xì)菌學(xué)和牙齒再礦化的藥效學(xué)研究方

3、法，系統(tǒng)、全面和科學(xué)評(píng)價(jià)中藥的防齲效果，為中藥防齲的深入研究提供有效的實(shí)驗(yàn)手段和方法。本研究在前期研究工作的基礎(chǔ)上，以五倍子和蜂房為實(shí)驗(yàn)藥物，研究中藥對(duì)口腔細(xì)菌和細(xì)菌生物膜的作用，建立中藥防齲藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌學(xué)評(píng)價(jià)方法，為中藥的藥效學(xué)研究方法增加新內(nèi)容。 方法：對(duì)與齲病發(fā)生關(guān)系密切的口腔細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)的體外實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證五倍子多酚性化合物(GCE)和五倍子B(GCE-B,30％乙醇提取物)以及蜂房95％組分(NVE1)對(duì)口腔細(xì)菌致齲毒

4、力因子的抑制作用，評(píng)估藥物對(duì)口腔5種與致齲密切相關(guān)的細(xì)菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)酸、產(chǎn)糖及粘附的作用：用MBEC<'TM>-HTP-Assay方法測(cè)定實(shí)驗(yàn)藥物五倍子和蜂房有效成分對(duì)口腔細(xì)菌生物膜的MBEC(Minimal biofilm eradication concentration)，研究和評(píng)估藥物對(duì)與齲病發(fā)生密切相關(guān)的5種單菌生物膜以及多菌生物膜生長(zhǎng)的抑制和清除作用；運(yùn)用半定量可見(jiàn)光測(cè)定OD值的方法以及熒光顯微鏡結(jié)合特異熒光染料標(biāo)記口腔細(xì)菌生

5、物膜中死菌和活菌的方法，研究和評(píng)估實(shí)驗(yàn)藥物五倍子和蜂房有效成分對(duì)口腔細(xì)菌生物膜的生物密度、對(duì)口腔細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)、對(duì)口腔細(xì)菌生物膜活性以及對(duì)口腔細(xì)菌生物膜中細(xì)菌代謝等方面的作用。 結(jié)果：通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)藥物五倍子和蜂房有效成分對(duì)口腔細(xì)菌致齲毒力因子的抑制作用研究，發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)細(xì)菌的產(chǎn)糖、產(chǎn)酸以及粘附的抑制作用均表現(xiàn)出良好的效果，為下一步研究藥物對(duì)口腔細(xì)菌生物膜的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)；研究藥物對(duì)齲病發(fā)生密切相關(guān)的5種細(xì)菌生物膜生長(zhǎng)的抑制作用，

6、發(fā)現(xiàn)口腔5種與齲病發(fā)生密切相關(guān)的細(xì)菌形成的單菌或多菌懸液都能在MBEC<'TM>-Device上形成良好的細(xì)菌生物膜(掃描電鏡觀察)。實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)口腔細(xì)菌生物膜的生長(zhǎng)抑制結(jié)果發(fā)現(xiàn)五倍子有效成分GCE和GCE-B對(duì)口腔生物膜細(xì)菌發(fā)揮了有效的抑制作用，蜂房有效成分NVE對(duì)單菌生物膜抑制作用明顯強(qiáng)于多菌生物膜；實(shí)驗(yàn)藥物五倍子和蜂房有效成分對(duì)口腔細(xì)菌生物膜的生物密度，形態(tài)結(jié)構(gòu)，生物膜活性以及代謝等方面影響的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種中藥有效成分對(duì)口腔細(xì)菌

7、生物膜都有一定的濃度依賴性，隨著藥物濃度提高，作用就越明顯。同一藥物濃度下，成熟細(xì)菌生物膜對(duì)藥物的敏感性比早期生物膜要小得多。就對(duì)口腔細(xì)菌生物膜密度影響來(lái)看，五倍子有效成分對(duì)口腔細(xì)菌生物膜的作用比蜂房有效成分顯著。五倍子和蜂房有效成分對(duì)口腔細(xì)菌生物膜的抑制作用不單純是對(duì)口腔生物膜細(xì)菌的殺滅作用，可能通過(guò)對(duì)口腔細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)的改變調(diào)整其內(nèi)部的細(xì)菌組成而發(fā)揮一定作用。 五倍子多酚性化合物(蚴和蜂房有效成分NVEl對(duì)24 h口腔細(xì)菌生物膜產(chǎn)

8、生的GTF活性發(fā)揮了有效的抑制作用。 結(jié)論：多指標(biāo)的、系統(tǒng)的、全面的和科學(xué)的研究中藥對(duì)口腔細(xì)菌及細(xì)菌生物膜的作用，建立中藥防齲細(xì)菌學(xué)的藥效學(xué)研究和評(píng)價(jià)方法，為今后中藥防齲的深入研究提供了有效的實(shí)驗(yàn)手段和評(píng)價(jià)方法；為中藥的藥效學(xué)研究方法增加了新內(nèi)容；MBEC<'TM>-HTP-Assay是測(cè)定口腔細(xì)菌生物膜MBEC重復(fù)性好，敏感度高，一次可以檢測(cè)多個(gè)樣本量的方法，比MIC更客觀的反應(yīng)生物膜細(xì)菌對(duì)中藥的敏感性，建立中藥防齲的藥物敏感