細胞凋亡相關基因Apr-3的克隆、細胞定位及多克隆抗體的制備.pdf

1、本研究通過克隆Apr-3的編碼區(qū)基因，對其進行細胞定位，并獲得了Apr-3原核表達蛋白和抗體，主要研究工作如下： 1.培養(yǎng)HL-60細胞，提取HL-60細胞總RNA，應用RT-PCR獲取Apr-3的轉(zhuǎn)錄剪接體2的編碼區(qū)cDNA序列，將該cDNA與質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His(-)B連接，構建克隆載體，將其轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，進行測序。 2.測序正確后將該cDNA與質(zhì)粒pEGFP-C3連接，并將其轉(zhuǎn)染COS-

2、7細胞。熒光顯微鏡藍色激發(fā)光下觀察綠色熒光蛋白表達的部位。 3.培養(yǎng)HL-60細胞，提取HL-60細胞總RNA，應用RT-PCR獲取Apr-3轉(zhuǎn)錄剪接體2編碼區(qū)cDNA序列的前366bp，將該cDNA與質(zhì)粒pcDNA3.0連接，構建克隆載體，將其轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，進行測序。 4.測序正確后將該cDNA與質(zhì)粒pET28a連接，構建原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導表達獲得Apr-3蛋白。并用Ni柱對獲得蛋白進行純化。

3、 5.用獲得的融合蛋白免疫新西蘭大白兔，制備兔多克隆抗體，用ELISA法檢測抗體滴度，用WesternBlot檢測Apr-3融合蛋白免疫學活性。 研究結果：對測序結果進行序列分析，與GenBank中登錄的Apr-3編碼區(qū)完全一致。pEGFP-Apr-3基因表達產(chǎn)物定位于COS-7細胞的細胞膜和細胞質(zhì)。應用RT-PCR獲取Apr-3編碼區(qū)cDNA序列的前366bp，將該cDNA與質(zhì)粒pcDNA3.0連接，構建克隆載體，將其

4、轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，進行測序，與GenBank中登錄序列比對，其結果正確后將該cDNA與質(zhì)粒pET28a連接，構建原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導表達獲得Apr-3蛋白。Apr-3融合蛋白主要以包涵體形式存在。獲得兔多克隆抗體，ELISA法檢測抗體效價為：1∶4000。用WesternBlot檢測Apr-3融合蛋白免疫學活性，顯示原核表達的蛋白可與多克隆抗體特異結合。 研究結論：對Apr-3基因的一個轉(zhuǎn)錄剪接體進行克隆，構