鵝催乳素受體基因克隆和多克隆抗體制備及組織表達(dá)分析.pdf

1、催乳素受體(Prolactin receptor，PRLR)是單次跨膜的受體蛋白，催乳素通過(guò)它在脊椎動(dòng)物中起著廣泛的生理作用。為理解鵝PRLR的生理作用，我們應(yīng)用RACE(Rapidamplification of cDNA ends)技術(shù)克隆了全長(zhǎng)為3，159bp的鵝催乳素受體基因(Prolactinreceptor gene，PRLR)cDNA并制備了PRLR兔抗鵝多克隆抗體，對(duì)洪澤湖鵝成體組織中mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)行了分析。同時(shí)，

2、對(duì)洪澤湖鵝PRLR5’-UTR內(nèi)存在的一個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　 1.鵝催乳素受體基因克隆及基因組織表達(dá)
　　 克隆的鵝PRLR cDNA全長(zhǎng)3，159bp，含443bp5’-UTR、2，496bp編碼區(qū)和220bp3’-UTR，編碼14個(gè)或以上外顯子。預(yù)測(cè)鵝PRLR含831個(gè)氨基酸(Amino acid，aa)，與雞、鴿及火雞PRLR同源性分別為87.7，85.2和84.8％，N-末端含一個(gè)24aa信號(hào)肽，胞外域

3、含兩個(gè)配體結(jié)合區(qū)。每個(gè)配體結(jié)合區(qū)內(nèi)含二對(duì)半胱氨酸殘基和一個(gè)WSEWS五肽WS基序。進(jìn)化分析表明，鵝PRLR在進(jìn)化中高度保守。克隆的cDNA序列比對(duì)表明，成年公鵝睪丸至少同時(shí)表達(dá)五種PRLR轉(zhuǎn)錄本。其中一種轉(zhuǎn)錄本由另一種轉(zhuǎn)錄本缺失第1外顯子后95bp形成；第三種轉(zhuǎn)錄本由不同于以上二種轉(zhuǎn)錄本的另一啟動(dòng)子選擇不同的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)起動(dòng)轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生一個(gè)新的第1外顯子，并直接剪接到第3外顯子而形成；第四種轉(zhuǎn)錄本缺失133bp的外顯子4a而不編碼或可能編碼

4、一種截短的PRLR蛋白異形體；第五種轉(zhuǎn)錄本是一種轉(zhuǎn)錄本異形體，編碼的蛋白異形體類似于非禽類其它脊椎動(dòng)物PRLR，即胞外域只含有一個(gè)配體結(jié)合區(qū)。RT-PCR結(jié)果表明，鵝PRLR mRNA在成年鵝睪丸，輸精管、卵巢、輸卵管、腎、大腸、小腸、脾組織中均有表達(dá)，其中以腎、睪丸、大腸及小腸中表達(dá)最為豐富。
　　 2.鵝催乳素受體多克隆抗體制備及受體組織表達(dá)
　　 構(gòu)建的exPRLR-pET-28a(+)轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli Ro

5、ster后，建立了可誘導(dǎo)的原核表達(dá)系統(tǒng)。在25℃培養(yǎng)、IPTG誘導(dǎo)條件下，表達(dá)催乳素受體胞外域重組蛋白exPRLR。超聲波裂解菌液上清及包涵體中的exPRLR使用Ni親和層吸柱純化，并用純化、復(fù)性的exPRLR免疫新西蘭白兔，制備兔抗鵝exPRLR抗血清，硫酸銨沉淀抗血清獲得多克隆抗體。然后多克隆抗體用原核表達(dá)的鵝PRLR胞外域重組蛋白及鵝組織表達(dá)的PRLR加以驗(yàn)證。同時(shí)，組織表達(dá)分析表明，成年母鵝組織中至少存在三種PRIR蛋白，它們或

6、許是經(jīng)典的PRLR蛋白及PRLR的蛋白異形體。
　　 3.鵝催乳素受體基因單核酸多態(tài)性及微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA提取液
　　 克隆的cDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)2個(gè)錯(cuò)配位點(diǎn)。位于編碼區(qū)內(nèi)的錯(cuò)配位點(diǎn)推測(cè)可能是一種沉默SNP，不改變蛋白序列；位于5’-UTR的錯(cuò)配位點(diǎn)在洪澤湖核心群內(nèi)被證明是一個(gè)SNP。同時(shí)，結(jié)合鵝微量羽髓細(xì)胞基因組DNA提取，我們研發(fā)了一種微量動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA提取液及相應(yīng)的提取方法。此方法實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物細(xì)胞基因組D