局部應(yīng)用不同濃度硝普鈉對創(chuàng)傷愈合影響的時效性研究.pdf

1、目的：通過制作大鼠背部創(chuàng)傷模型，并給予不同濃度的硝普鈉(sodiumnitroferricyanide，SNP)進(jìn)行干預(yù)，觀察外源性一氧化氮(nitricoxide，NO)在創(chuàng)傷愈合過程中對傷口愈合時間、肉芽組織生長及表皮細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用免疫組化方法，揭示創(chuàng)傷愈合時一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)的表達(dá)規(guī)律；通過光鏡觀察愈合期間不同階段的成纖維細(xì)胞數(shù)量及膠原纖維含量；通過組織化學(xué)方法檢測肉芽組織中的羥脯

2、氨酸含量，研究NO對預(yù)防傷口病理性瘢痕形成及促進(jìn)傷口愈合的量效關(guān)系，并探討其機(jī)制，為臨床上應(yīng)用NO供體抑制病理性瘢痕形成及促進(jìn)傷口愈合提供理論依據(jù)。 方法：1、實(shí)驗(yàn)動物：雄性健康Wistar大鼠60只，稱重，編號。2、實(shí)驗(yàn)動物分組：將大鼠隨機(jī)分為5組：即對照組(5％葡萄糖溶液)、實(shí)驗(yàn)組A(0.5mmol/LSNP)、B(1mmol/LSNP)、C(2mmol/LSNP)、D(4mmol/LSNP)。每組12只。3、創(chuàng)傷模型制備方

3、法：大鼠背部剪毛，10％硫化鈉脫毛，溫水清洗，拭干。次日，用10％水合氯醛腹腔注射麻醉(30mg/kg)成功后，將大鼠固定于手術(shù)臺上。在背部脊柱兩側(cè)旁開1cm，頭尾兩端平行于脊柱各標(biāo)記一直徑1.8cm，面積2.54cm2的圓形切口線。經(jīng)碘伏消毒皮膚后，用剪刀沿標(biāo)記線剪除全層皮膚至深筋膜，形成4個圓形創(chuàng)面。取相應(yīng)濃度溶液注射于創(chuàng)面筋膜層及創(chuàng)緣皮下組織內(nèi)，每個創(chuàng)面0.5ml，無菌紗布包扎。隔日換藥一次(處死動物當(dāng)天不換藥)，將相應(yīng)藥液注射至

4、新生肉芽組織內(nèi)，每個創(chuàng)面0.5ml，直至處死動物。4、取材：每組動物分為4組，每組3只，分別于術(shù)后第3、7、10、14天切取原創(chuàng)傷范圍內(nèi)組織，隨機(jī)將一塊組織固定于4％多聚甲醛中，常規(guī)石蠟包埋切片，分別行常規(guī)HE染色、VG染色及免疫組化染色。剩余3塊組織于-20℃冷凍保存，行組織化學(xué)檢測。5、觀測指標(biāo)：(1)大體觀察。(2)成纖維細(xì)胞數(shù)密度(numericaldensityonarea,NA)：400倍光鏡下觀察HE染色切片，在肉芽組織中

5、央淺部、中央深部、兩側(cè)部各隨機(jī)選取10個矩形視野(0.0052mm2/視野)，目測計(jì)數(shù)并計(jì)算切片內(nèi)單位面積成纖維細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果取均數(shù)。(3)膠原纖維面密度(areadensityonarea，AA)：VG染色組織切片，在肉芽組織中央淺部、中央深部、兩側(cè)部各隨機(jī)選取5個視野，利用計(jì)算機(jī)輔助病理圖象分析系統(tǒng)計(jì)算紅染的膠原纖維的面密度，結(jié)果取均數(shù)。(4)按照羥脯氨酸測定試劑盒說明書操作測定肉芽組織羥脯氨酸含量。(5)對免疫組化染色切片，光鏡觀

6、察NOS分布部位和著色深淺程度。采用數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)，測陽性目標(biāo)面密度。(6)按照NOS試劑盒說明書操作測定創(chuàng)面肉芽組織NOS總量及iNOS含量。6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件，行兩組間樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1、形態(tài)學(xué)觀察：對照組于創(chuàng)傷后14天可完全愈合；實(shí)驗(yàn)A組及B組肉芽組織生長良好，且愈合時間較對照組提前3-4天；實(shí)驗(yàn)C組及D組愈合情況不良，完全愈合時間延遲，皮膚張力較

7、低，炎癥反應(yīng)明顯。2、光鏡觀察：實(shí)驗(yàn)A組及B組在創(chuàng)傷后3天比對照組有較多毛細(xì)血管生成，創(chuàng)傷后14天成纖維細(xì)胞排列整齊；實(shí)驗(yàn)C組及D組較對照組呈明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞生長不良。3、成纖維細(xì)胞數(shù)密度(NA)：實(shí)驗(yàn)A組及B組在創(chuàng)傷后3、7、10天NA均高于對照組水平(P＜0.01)，而在創(chuàng)傷后14天低于對照組(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)C組在創(chuàng)傷后7、10天NA高于對照組水平(P＜0.01)，而在第14天低于對照組水平(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)

8、D組在第3天和第14天時NA低于對照組水平(P＜0.01)。4、膠原纖維面密度(AA)：五組AA均呈持續(xù)性增加趨勢，實(shí)驗(yàn)A組在所有時間點(diǎn)均高于對照組(P＜0.01)；B組在創(chuàng)傷后3、7、10天AA高于對照組(第3、10兩天P＜0.01，第7天P＜0.05)；C組在第7天時AA低于對照組(P＜0.05)，第10天時高于對照組(P＜0.01)；D組在創(chuàng)傷后第3天和第7天AA較對照組低(P＜0.01)，其后AA與對照組相近。5、羥脯氨酸含量：

9、對照組羥脯氨酸含量從創(chuàng)傷后第3天到第14天進(jìn)行性增加；實(shí)驗(yàn)A組在創(chuàng)傷后第3、7天羥脯氨酸含量低于對照組，差異有顯著性(第3天P＜0.05，第7天P＜0.01)，而在第10天和第14天羥脯氨酸含量均高于對照組(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)B組和C組在第10天和第14天的羥脯氨酸含量明顯高于對照組(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)D組僅在創(chuàng)傷后第3天表現(xiàn)比對照組多(P＜0.01)，其余均與對照組水平相近。6、NOS蛋白免疫組化表達(dá)：大鼠皮膚創(chuàng)傷后角質(zhì)形成細(xì)胞、

10、汗腺、毛囊和骨骼肌細(xì)胞以及創(chuàng)傷后肉芽組織的炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均不同程度的表達(dá)NOS蛋白。對照組在第3天和第14天分別呈現(xiàn)NOS陽性顆粒表達(dá)高峰，而實(shí)驗(yàn)各組僅在第7-10天出現(xiàn)NOS陽性表達(dá)高峰，呈先增加后減少的趨勢。7、iNOS及總NOS含量的測定：對照組iNOS含量在第3天和第10天含量較高；實(shí)驗(yàn)各組iNOS含量呈先增加后降低的趨勢，最高點(diǎn)在第7-10天。對照組NOS總量在第3天和第14天時較高；實(shí)驗(yàn)A組NOS總量呈持

11、續(xù)性增加；B組NOS總量呈先增加后降低趨勢，高峰位于第10天；C組及D組總NOS含量在第3天和第7天保持較高水平，第10-14天呈逐漸下降的趨勢。 結(jié)論：局部應(yīng)用外源性NO具有顯著的促修復(fù)作用，但并非作用于修復(fù)全過程，而是主要體現(xiàn)在傷后第7-10天，而且小劑量的NO促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大劑量NO。局部過量的NO聚積可阻礙正常的傷口愈合，并呈現(xiàn)全身毒性反應(yīng)。在傷后7-10天應(yīng)用外源性NO可減輕內(nèi)源性NO缺乏狀態(tài)，并抑制病理性