Cajal樣間質(zhì)細胞在膽囊膽固醇結(jié)石形成中的作用.pdf

1、目的：膽囊膽固醇結(jié)石的形成機制一直是國內(nèi)外膽道疾病領(lǐng)域的研究熱點,已有的研究表明膽囊動力障礙在膽囊膽固醇結(jié)石的形成中發(fā)揮了重要作用。以往的研究多集中于觀察成石過程中膽囊動力發(fā)生變化的現(xiàn)象,而對其發(fā)生機制的探討不足。有研究認為,高膽固醇誘發(fā)動物成石過程中膽囊動力的下降可能是膽固醇通過調(diào)節(jié)離子通道活性或是通過改變細胞膜上的受體-配體結(jié)合或是通過改變收縮蛋白活性實現(xiàn)的。隨著Cajal間質(zhì)細胞在胃腸動力中的調(diào)節(jié)作用被肯定,其在膽囊動力調(diào)控中的作

2、用以及與膽系疾病發(fā)生的關(guān)系成為人們關(guān)注的熱點。本課題以在豚鼠和人體膽囊中發(fā)現(xiàn)Cajal樣間質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)證據(jù)為基礎(chǔ),以高膽固醇誘發(fā)動物成石過程中膽囊動力下降的現(xiàn)象為線索,探討Cajal樣間質(zhì)細胞在豚鼠膽囊膽固醇結(jié)石形成中的作用。我們通過建立豚鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型,觀察豚鼠膽囊中Cajial樣間質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)特征,同時觀察膽固醇結(jié)石形成過程中Cajal樣間質(zhì)細胞的變化及膽囊對外源性膽囊收縮素CCK收縮反應(yīng)的變化,初步探討膽囊膽固

3、醇結(jié)石形成過程中膽囊動力下降的機制。并進一步比較正常離體膽囊肌條及去除Cajal樣間質(zhì)細胞的膽囊肌條慢波和張力的變化,探討Cajal樣間質(zhì)細胞與CCK的作用關(guān)系,分析CCK發(fā)揮促膽囊收縮的可能機制。另外采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及蛋白印記方法比較對照組與成石組豚鼠膽囊c-kit及scf mRNA和蛋白表達的變化情況,從分子生物學(xué)角度分析Cajal樣間質(zhì)細胞發(fā)生變化的可能信號途徑。為臨床治療和預(yù)防膽囊膽固醇結(jié)石提供新的理論依據(jù)。
　　

4、 方法：
　　 一、實驗對象
　　 健康雄性豚鼠100只,體重120～150g,隨機分為2組:(對照組/CON組50只,致石組/CG組50只),適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,分別給予普通飼料及致石飼料。致石周期為6周,飼養(yǎng)期結(jié)束后觀察各指標(biāo)。
　　 二、標(biāo)本采集
　　 10％水合氯醛腹腔注射麻醉后采集豚鼠膽囊標(biāo)本、膽囊膽汁標(biāo)本、膽石標(biāo)本。
　　 三、實驗方法和檢測指標(biāo)
　　 1、致石率評定及紅外光譜結(jié)

5、石定性:解剖顯露豚鼠膽囊,肉眼即可清晰辨別膽囊結(jié)石形成情況,采用紅外光譜溴化鉀壓片法,對結(jié)石成分進行定性,統(tǒng)計結(jié)石形成率。
　　 2、膽囊膽汁涂片后于偏振光顯微鏡下觀察。
　　 3、制各豚鼠膽囊丙酮灌注標(biāo)本及膽囊全層鋪片標(biāo)本。
　　 4、免疫組織熒光化學(xué)染色方法研究豚鼠膽囊組織中Cajal樣間質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)和分布特征。并比較對照組與致石組Cajal樣間質(zhì)細胞數(shù)量和形態(tài)的變化。
　　 5、透射電鏡下觀察豚鼠

6、膽囊Cajal樣間質(zhì)細胞的超微結(jié)構(gòu)特征。
　　 6、頸靜脈置管后以17nmol/kg的劑量給予外源性CCK-8,收集每10min肝膽汁計量統(tǒng)計。
　　 7、制備離體豚鼠膽囊肌條,RM6240HJ型多道生理信號采集處理系統(tǒng)記錄膽囊肌條慢波情況,比較正常組與去除Cajal樣間質(zhì)細胞組膽囊肌條慢波頻率和振幅的變化。
　　 8、RM6240HJ型多道生理信號采集處理系統(tǒng)記錄膽囊肌條張力情況,比較正常組與去除Cajal樣間

7、質(zhì)細胞組膽囊肌條對不同濃度CCK-8的收縮反應(yīng)變化。
　　 9、Western Blot法研究對照組與致石組膽囊組織中c-kit蛋白的變化情況。取膽囊組織標(biāo)本,提取蛋白,SDS凝膠電泳,ECL化學(xué)發(fā)光法檢測c-kit蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平的變化情況。
　　 10、Western Blot法研究對照組與致石組scf蛋白的變化情況,方法同上。
　　 11、RT-PCR法研究對照組與致石組膽囊組織中c-kit蛋白在mRNA水

8、平上的改變:取膽囊組織標(biāo)本,提取總RNA,擴增目的基因,觀察c-kit蛋白在mRNA水平的變化情況。
　　 12、RT-PCR法研究對照組與致石組膽囊組織中scf蛋白在mRNA水平上的變化情況,方法同上。
　　 結(jié)果：
　　 一、豚鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型構(gòu)建情況對照組豚鼠成石率為0％(0/43),致石組豚鼠成石率為100％(35/35),明顯高于對照組。結(jié)石經(jīng)溴化鉀壓片法紅外光譜檢測證實為膽固醇結(jié)石。
　　

9、 偏振光顯微鏡下對照組膽囊膽汁內(nèi)未見膽固醇結(jié)晶,致石組膽囊膽汁可見典型膽固醇結(jié)晶。
　　 二、豚鼠膽囊Cajal樣間質(zhì)細胞免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果豚鼠膽囊肌層中存在c-kit陽性的ICLCs,細胞呈梭形或衛(wèi)星形,胞核巨大,為卵圓形,核周胞漿少,有2～5個長分支細胞突起?？梢杂^察到ICLCs之間緊密相連。致石組ICLCs平均陽性面積較對照組明顯減少(18.37±0.64％ vs2.47±0.28％,t=21.122,P＜0.01)。<

10、br>　　 三、豚鼠膽囊CajaIl間質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)觀察ICLCs呈長的,電子密度高的,肌樣的細胞。染色質(zhì)分散,胞質(zhì)少。胞內(nèi)有液泡,基底膜不完整。這些細胞直接與GBSM細胞接觸,還發(fā)現(xiàn)ICLCs被無髓神經(jīng)纖維包繞。
　　 四、豚鼠膽囊收縮功能實驗(CCK-8干預(yù)實驗)外源性CCK-8干預(yù)實驗顯示致石組膽囊膽汁時間流量曲線下面積較對照組明顯減少,膽囊對CCK-8反應(yīng)性下降。
　　 五、豚鼠離體膽囊肌條慢波和張力的測定結(jié)果

11、正常組膽囊肌條慢波頻率為27.9±1.91次/min,變異系數(shù)為6.85％,慢波振幅為0.63±0.07mV,變異系數(shù)為10.97％。亞甲藍染色組膽囊肌條慢波頻率為26.81±1.87次/min,變異系數(shù)為6.99％,慢波振幅為0.61±0.06mV,變異系數(shù)為9.48％;ICLCs破壞組膽囊肌條慢波頻率為9.92±1.52次/min,變異系數(shù)為15.4％,慢波振幅為0.16±0.03mV,變異系數(shù)為20.37％,與正常組及單純亞甲藍染

12、色組相比頻率減低,振幅減小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 正常組膽囊肌條對10-5mol/L、10-6mol/L、10-17mol/L及10-8mol/L的CCK-8反應(yīng)的張力效應(yīng)值分別為2.82±0.36g、1.42±0.25g、1.11±0.15g和0.64±0.08g;單純亞甲藍染色組膽囊肌條的相應(yīng)效應(yīng)值分別為2.77±0.35g、1.37±0.27g、1.11±0.16g和0.58±0.1g;ICLCs破壞組

13、膽囊肌條的相應(yīng)效應(yīng)值分別為0.53±0.11g、0.34±0.03g、0.16±0.05g和0.06±0.02g,與正常組及單純亞甲藍染色組相比張力效應(yīng)值明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 破壞ICLCs組,細胞明顯腫脹,線粒體腫脹,細胞質(zhì)膜內(nèi)多發(fā)空泡變性伴破裂,而平滑肌細胞未受影響。
　　 六、豚鼠膽囊c-kit及scf蛋白改變情況Western Blot結(jié)果顯示,與對照組相比,致石組豚鼠膽囊c-kit

14、(t=10.256,P＜0.01)及scf蛋白(t=9.586,P＜0.01)表達量下降。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,致石組豚鼠膽囊c-kit(1=6.985,P＜0.01)和scf(t=6.028,P＜0.01)的tuRNA水平的表達量下降。
　　 結(jié)論：
　　 1、飲食誘導(dǎo)的豚鼠膽囊膽固醇結(jié)石形成過程中,膽囊Cajal樣間質(zhì)細胞明顯減少,膽囊動力受損,對外源性CCK反應(yīng)下降。
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